Name: דוגמנות ממברנות ביולוגיות עם מעגלים מדידת אותות חשמליים בתוך האקסונים: מעבדה תרגילים סטודנטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-18T18:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 56 s
Description: למדו מודלים חשמליים של ממברנות ביולוגיות באמצעות מעגלים מודדים ורשומות פוטנציאלי פעולה מחוט העצב הגבי של סרטן הנהרות. שיטה זו מספקת ניסיון מעשי בחקר פיזיולוגיה עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ניסויים אלה שונו מן ידני מעבדה, שבו נעשה שימוש בקורס, בניצוחו של ד&quot;ר HL אטווד, במחלקה לזואולוגיה, אוניברסיטת טורונטו. תרגילים שימשו גם שונה מן מדריך זה הופק עבור &quot;הסדנה 6 ה IBRO אינטנסיבי BASIC Neuroscience&quot; ו נערך באוניברסיטת קוריאה, סיאול, דרום קוריאה בשנת 1993 (Cooper et al. 1993). שינויים הנוכחית נדרשו להשתמש בציוד משותף להציג יום הסטודנט במעבדות מכוונת באוניברסיטאות שונות. נתמך על ידי אוניברסיטת קנטקי, החוג לביולוגיה, משרד לימודי הסמכה ו במכללה לאמנויות ומדעים.

<ol><li>Bennett, M. V. L., Barrio, L. C., Bargiello, T. A., Spray, D. C., Hertzberg, E., Sdez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctions%3A+new+tools%2C+new+answers%2C+new+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Gap junctions: new tools, new answers, new questions.</a> Neuron. 6, 305-320 (1991).</li>
<li>Bernardini, G., Peracchia, C., Peracchia, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+effects+of+heptanol+on+gap+junction+structure+and+cell-to-cell+electrical+coupling%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Reversible effects of heptanol on gap junction structure and cell-to-cell electrical coupling.</a> European Journal of Cell Biology. 34 (2), 307-312 (1984).</li>
<li>A report on the, "SIXTH INTENSIVE IBRO WORKSHOP ON BASIC NEUROSCIENCE". Cooper, R. L., Chang, J. J., Ito, M. July 1993, Seoul, South Korea, , Society for Neuroscience. 116-116 (1985).</li>
<li>Cragg, B. G., Thomas, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+between+conduction+velocity+and+the+diameter+and+internodal+length+of+peripheral+nerve+fibers.%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The relationship between conduction velocity and the diameter and internodal length of peripheral nerve fibers.</a> Journal of Physiology. 136, 606-614 (1957).</li>
<li>Erlanger, J. G. asser, S, H., Bishop, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+compound+nature+of+the+action+current+of+nerves+as+disclosed+by+the+cathode+ray+oscillograph%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">The compound nature of the action current of nerves as disclosed by the cathode ray oscillograph.</a> American Journal of Physiology. 70, 624-666 (1924).</li>
<li>Furshpan, E. J., Potter, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+at+the+giant+motor+synapses+of+the+crayfish%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Physiology%22%5BJournal%5D)">Transmission at the giant motor synapses of the crayfish.</a> Journal of Physiology. 145 (2), 289-325 (1959).</li>
<li>Johnston, M. F., Simon, S. A., Ramrn, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interaction+of+anesthetics+with+electrical+synapses%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Interaction of anesthetics with electrical synapses.</a> Nature (Lond). 286, 498-500 (1980).</li>
<li>Loewenstein, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Permeability+of+membrane+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+NY+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Permeability of membrane junctions.</a> Annual NY Academy of Sciences. 137, 441-472 (1966).</li>
<li>Meda, P., Bruzzone, R., Knodel, S., Orci, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockage+of+cell-to-cell+communication+within+pancreatic+acini+is+associated+with+increased+basal+release+of+amylase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Blockage of cell-to-cell communication within pancreatic acini is associated with increased basal release of amylase.</a> Journal of Cell Biology. 103 (2), 475-483 (1986).</li>
<li>Peracchia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+gap+junction+resistance+with+acidification+in+crayfish+septate+axons+is+closely+related+to+changes+in+intracellular+calcium+but+not+hydrogen+ion+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Increase in gap junction resistance with acidification in crayfish septate axons is closely related to changes in intracellular calcium but not hydrogen ion concentration.</a> Journal of Membrane Biology. 113 (1), 75-92 (1990).</li>
<li>Peracchia, C., Dulhunty, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+resistance+junctions+in+crayfish%3A+structural+changes+with+functional+uncoupling%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Low resistance junctions in crayfish: structural changes with functional uncoupling.</a> Journal of Cell Biology. 70, 419-439 (1976).</li>
<li>Peracchia, C., Bernardini, G., Peracchia, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+calmodulin+involved+in+the+regulation+of+gap+junction+permeability%5BTitle%5D)+AND+%22Pf%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Is calmodulin involved in the regulation of gap junction permeability.</a> Pfügers Arch. 399, 152-154 (1983).</li>
<li>Peracchia, C., Lazrak, A., Peracchia, L. L. Molecular models of channel interaction and gating in gap junctions. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPeracchia%2C+C+%22Handbook+of+Membrane+Channels.+Molecular+and+Cellular+Physiology%22">Handbook of Membrane Channels. Molecular and Cellular Physiology</a>. Peracchia, C. , Academic Press. San Diego. 361-377 (1994).</li>
<li>Spray, D. C., Harris, A. L., Bennett, M. V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gap+junctional+conductance+is+a+simple+and+sensitive+function+of+intracellular+pH%5BTitle%5D)+AND+%22Sciences+NY%22%5BJournal%5D)">Gap junctional conductance is a simple and sensitive function of intracellular pH.</a> Sciences NY. 211, 712-715 (1981).</li>
<li>Spray, D. C., Harris, L. L., Bennett, M. V. L. Comparison of pH and Ca dependence of gap junctional conductance. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSpray%2C+DC+%22Intracellular+pH%3A+Its+Measurement%2C+Regulation%2C+and+Utilization+in+Cellular+Functions%22">Intracellular pH: Its Measurement, Regulation, and Utilization in Cellular Functions</a>. Nuccitelli, R., Deamer, D. , Alan R. Liss. New York. 445-461 (1982).</li>
<li>Spray, D. C., White, R., De Carvalho, C., Harris, A. L., Bennett, M. L. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+of+gap+junction+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Gating of gap junction channels.</a> Journal of Biophysics. 45, 219-230 (1984).</li>
<li>Watanabe, A., Grundfest, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impulse+propagation+at+the+septal+and+commissural+junctions+of+crayfish+lateral+giant+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Impulse propagation at the septal and commissural junctions of crayfish lateral giant axons.</a> Journal of General Physiology. 45, 267-308 (1961).</li>
<li>Wiersma, C. A. G., Hughes, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+functional+anatomy+of+neuronal+units+in+the+abdominal+cord+of+the+crayfish%2C+Procambarus+clarkii%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">On the functional anatomy of neuronal units in the abdominal cord of the crayfish, Procambarus clarkii.</a> Journal of Comparative Neurology. 116, 209-228 (1961).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

המטרה שלנו במצגת on-line את הווידאו הזה הנייר כדי להוכיח את מאפייני biophysical של תאים יכולים, בין השאר, להיות המודל כמו מעגלים חשמליים. בנוסף, עם רקמה עצבית לחיות כי הוא יחסית להשיג בקלות, עקרונות היסוד של מהירות ההולכה, תקופות עקשן וטכניקות הקלטה אלקטרו אפשריים עבור מעבדות סטודנט לתואר ראשון עם השקעה צנועה של ציוד. נושאים ופרדיגמות היסוד שהוצגו ניתן לשנות בקלות את הדרישות של קורסים שונים. תחזוקה של סרטנים ושפע שלהם הופך אותם מודלים אטרקטיבי עבור ניסויים סטודנט מונחה. מיתרי סרטנאים עצב הגחון הם בדרך כלל חזקים ולשמור על שלמות פיזיולוגיים מלוחים מינימלית במשך שעות, וזה מתאים במעבדה סטודנט 3 שעות. בהינתן כי חלק מן האקסונים גדולים VNC של סרטנים מחוברים דרך צמתים הפער, ניסויים נוספים על תרומתם ניתן לבצע ומאפיינים שונים מאשר למצוא את הכנת צפרדע רגיל עצב השת ניתן להדגים. עצב השת הוא מודל קלאסי לטיפול פעולה מתחם הפוטנציאלים ומאפיינים הולכה. זה יכול להיות גם ניסוי השוואתי מעניין לסטודנטים להשוות תכונות הולכה, גיוס האקסון, ותקופות עקשן בין שתי ההכנות.

המעגלים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרוניקה המפורטים להלן עבור הניסויים קרש החיתוך ניתן להשיג בחנות האלקטרוניקה המקומית כגון רדיו שאק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הלוח לחם, נגדים, קבלים, סוללות וחוטים שיכולים לשמש עבור צמתים קרש החיתוך כפי שמתואר הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> וולטמטר משותף (Wavetek Meterman וולטמטר) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> A / D הלוח על קו ההקלטה למחשב. אותות חשמל נרשמות על הקו לממשק PowerLab/4s (ADInstruments, קולורדו ספרינגס, קולורדו, ארה&quot;ב). אנו משתמשים בתוכנה מבית תקן ADInstruments בשם תרשים או היקף. </li></ol> פיזיולוגיה ניסויים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרטן הנהרות (Procambarus כלארקיי). Atchafalaya ביולוגית אספקת ושות, Raceland, לוס אנג&#39;לס., ארה&quot;ב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן סרטנים מלוחים: השתנה מפתרון של ואן Harreveld (1936). (מ&quot;מ) 205 NaCl, KCl 5.3, 13.5 CaCl 2 2H 2 O, 2.45 MgCl 2 6 שעות 2 O; 5 HEPES והותאמו pH 7.4. כימיקלים כל מלוחים התקבלו Sigma כימיים החברה (סנט לואיס, מיזורי). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Dissection כלים: פיין # 5 פינצטה, מספריים בסדר, בעל להב סכין, # 26002-20 סיכות חרקים (להשיג כל כלי מן המדע פיין (ארה&quot;ב), Inc, 373-G Vintage פארק דרייב, פוסטר סיטי, קליפורניה 94404-1139) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא עצב צלחת (ADInstruments, קולורדו ספרינגס, קולורדו, ארה&quot;ב) כדי להחזיק את העצב. החוטים שמגיעים עם המנה תא העצב יכול לשמש כדי לגרות את העצב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אלקטרודה יניקה משמש כדי להקליט את האותות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניפולטור או מהדק על דוכן טבעת ישמש גם מחזיק את האלקטרודה יניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פאראדיי קייג&#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביתור מיקרוסקופ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עוצמת הפנס גבוהה (מקור האור) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיקרוסקופ רציף </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AC / DC דיפרנציאלי מגבר (AM דגם מערכות בע&quot;מ 3000) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PowerLab 26T (מכשירים לספירה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מגבר תאיים (מכשירים לספירה) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> LabChart 7 (ADI מכשירים) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביתור כלים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טבעת לעמוד מהדק לשמש בעל עבור האלקטרודה יניקה הקלטה </li></ol>

דוגמנות ממברנות ביולוגיות עם מעגלים מדידת אותות חשמליים בתוך האקסונים: מעבדה תרגילים סטודנטים

Modeling Biological Membranes with Circuit Boards and Measuring Electrical Signals in Axons: Student Laboratory Exercises

זוהי הפגנה של כמה מודלים חשמלי יכול לשמש כדי לאפיין קרומים ביולוגיים. תרגיל זה גם מציג המינוח biophysical בשימוש electrophysiology. הציוד אותו הוא משמש מודל הממברנה כמו לחיות על ההכנות. כמה מאפיינים של חוט העצב מבודד נחקרות: פוטנציאל הפעולה העצבי, גיוס של נוירונים, ואת ההיענות של חוט העצב לגורמים סביבתיים.

זוהי הפגנה של כמה ממברנות ביולוגיות ניתן להבין באמצעות מודלים חשמל. אנחנו גם מדגימים נהלים הקלטה פוטנציאל פעולה מחוט עצב הגחון של סרטנים עבור מעבדות סטודנט חוקיים.

זוהי הדגמה של האופן שבו ניתן להשתמש במודלים חשמליים כדי לאפיין ממברנות ביולוגיות. תרגיל זה מציג בנוסף טרמינולוגיה ביופיזית...

המטרה הכללית של הליך זה היא להדגים כיצד ניתן להבין ממברנות ביולוגיות באמצעות מודלים חשמליים, ולהדגים נהלים להקלטת פוטנציאלי פעולה מחבל העצבים הגבי (ventral nerve cord) של סרטני נהר (crayfish). הדגמה זו משתמשת תחילה ברכיבי מעגל על לוח ניסיונות (breadboard) כדי לייצג את התכונות החשמליות של ממברנות. השלב השני של ההליך הוא שינוי ההתנגדות והקיבול במעגל מודל כדי לבחון את ההשפעות על עקומות המתח.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא יישום מושגים שנלמדו ממעגל מודל על תכשירי עצב חיים. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא הקלטה של פוטנציאלי פעולה מורכבים והבנת התכונות של תקופות רפרקטוריות של סף והעברה סינפטית. בסופו של דבר, התוצאות מראות כיצד בחינת מודלים של מעגלים חשמליים של ממברנות ביולוגיות ותכונות של עצבים חיים יכולה לשמש ככלי הוראה יעיל, כפי שהודגם על ידי שינוי רכיבי מעגל המודל ושינוי רמת הגירוי של העצב החי.שיטה זו יכולה לספק תובנות לגבי האופן שבו ניתן להבין ממברנות ביולוגיות במונחים של מודלים חשמליים. ניתן להחיל אותה גם על רקמות אחרות, כגון שריר Visual. הדגמה של שיטה זו היא קריטית, שכן נתיחה של חבל העצבים הגחוני (ventral nerve cord) והקמת מערך ההקלטה עלולות להיות קשות בתחילה, ויש לנקוט משנה זהירות כדי למנוע פגיעה בעצבים, וזאת על מנת להשיג מערך תקין לגירוי ולהקלטה מחבל העצבים.בחלקה הראשון של הניסוי, משתמשים בנגדים ובקבלים כדי לדמות את הפעילות החשמלית של ממברנת תאי העצב. למעגל הראשוני יש נגדים בלבד. קבלים מתווספים בשלב מאוחר יותר.התכונות ההתנגדותיות הפסיביות של קרום העצב מיוצגות על ידי המעגל המוצג כאן. לוח הבדיקה (breadboard) מורכב מנגדים במקביל של 33 kilo ohms, המייצגים את התנגדות הקרום הרוחבית, ומנגדים בטור של 10 kilo ohms המייצגים את ההתנגדות התוך-תאית. מעגל זה מניח כי ההתנגדות של הנוזל החיצוני זניחה בהשוואה להתנגדויות התוך-תאיות והרוחביות של הקרום.כאשר תא המודל הושלם, חברו את מוצאי כבלי ה-power lab למודל שעל לוח הבחן (breadboard). ה-power lab מייצר את הגירוי וכולל גשש מדידה להקלטת מתח. לאחר מכן, חברו את ה-power lab למחשב.המחשב משמש להצגת האותות החשמליים שהוקלטו מלוח הבדיקות (breadboard). השלב הבא הוא הגדרת תוכנת המחשב שתבקר את הגירוי הנשלח על ידי ה-power lab לתא העצב המודלי. פתחו את תוכנת ה-lab chart משולחן העבודה.בחרו קובץ חדש (new file), בחרו הגדרה (setup), ולאחר מכן הגדרות ערוץ (channel settings). בחרו ערוץ אחד שיוצג, ולאחר מכן בחרו בלוח המעורר (stimulator panel). נדרשים פולסים ארוכים של 1.5 volts.עבור חלק זה של הניסוי, כווננו את האמפליטודה ל-1 volt. ה-power lab יפלוט מתח התנודד בין 0.5 volts חיובי לשלילי, מה שיוביל לגירוי שיא של 1 volt. הגדירו את התדר ל-0.75 hertz ואת משך הפולס לשנייה אחת.עבור הגדרות הערוץ, בחרו בערוץ אחד לניטור, לחצו על מגבר הכניסה ובתיבה, לחצו על כפתור הדיפרנציאל (differential), הגדירו את הטווח ל-5V ובחרו ב-Okay. השלב הבא הוא להפעיל אות חשמלי על מודל תא העצב ולבחון את דעיכת האות לאורך מודל התא. הפעילו מתח בקצה אחד של המעגל בין A ל-B על ידי לחיצה על Start במחשב.מדדו את המתח עבור יחידת האורך הראשונה לאורך אקסון המודל ועקבו אחריו במחשב. השאירו את המגש האדום של גשש מדידת המתח נייח בנקודה A על לוח הבדיקות (breadboard), בעודכם מזיזים את המגש השני למיקומים שונים בין נגדי הטור. שימו לב למפל המתח במיקומים המרוחקים יותר.כעת הפסיקו את ההקלטה על ידי לחיצה על stop במחשב. מדדו את הפרשי המתח שנשמרו בעקבות הגרפים (traces) המאוחסנים במחשב, באמצעות הסמן להזזת הגרף לכל פולס שהוקלט. השתמשו בסמן ה-M marker שנמצא בפינה השמאלית התחתוית כדי לסמן את בסיס הגרף, והניחו את הסמן החופשי בשיא הגרף כדי למדוד את הפרש המתח.קראו את מדידת הפרש המתח מהמסך ורשמו אותה במחברת עבור כל נקודת מדידה לאורך המעגל. השלב הבא הוא חישוב קבוע האורך עבור תא המודל, המשמש לתיאור הדעיכה המעריכית של האות לאורך מרחק. שרטטו כל ערך של הפרש מתח על גרף של הפרש פוטנציאל אל מול המרחק מהמקור, כאשר נגדי הממברנה נחשבים ליחידה אחת.בנפרד מהגרף שלך, קבע את קבוע האורך של מעגל זה. קבוע האורך של סיב עצב מוגדר כמרחק שבו הפרש הפוטנציאל לאורך הממברנה יורד ל-37% מערכו המקורי בנקודת המוצא. על מנת לדמות טוב יותר את תכונות הכבל הפסיבי של סיבי עצב ושריר, תורחב מודל תא העצב כך שיכיל רכיבים התנגדותיים וקיבוליים כאחד.במעטפת תא העצב לא קיים רק התנגדות קרומית רוחבית, אלא גם קיבוליות קרומית שטחית, המעוותת את אות תא העצב. כדי לדמות זאת, חברו 10 קבלים של 10 pF במקביל לקרומי הרוחב. נגדים על לוח הבחנה במחשב.הגדירו את הסטימולטור לשימוש בשנייה אחת, וולט אחד, שזו הגדרה של אמפליטודה של 0.5 volt ופולסים של 0.75 hertz. כמו כן, בצד הימני העליון של הפאנל, הגדירו את קצב הדגימה ל-20 K לשנייה. לאחר מכן, לחצו על ערוץ אחת בצד ימין של המסך.לחצו על מגבר הכניסה (input amplifier) בתיבה. לחצו על כפתור הדיפרנציאלי והגדירו את הטווח לחמישה וולטים. לחצו על אישור.כדי לשמור שינויים אלו, לחץ על start כדי להתחיל באיסוף הנתונים. מדוד את הנתונים באותן נקודות לאורך לוח הבדיקות (breadboard). לאחר איסוף הנתונים, השתמש בחלון הזום כדי להגדיל את זמן העלייה (rise time) באחד מפולסי הריבוע.חזור על פעולת הזום לפי הצורך כדי לפרוש את העקבה. מדוד את הזמן שלוקח לאות לעלות מקו הבסיס לראש עקבת המתח, בדיוק בנקודה שבה הוא מתייצב.עקוב אחר מהלך הזמן של שינוי הפוטנציאל ושל העיוות בפולסים המרובעים. כמו כן, שים לב אם המתח שנמדד גבוה מ-0.2 volts באמצעות הסמן M והסמן החופשי כפי שנעשה קודם לכן; קרא את השינוי במתח ורשום את הנתונים במחברת שלך, בהנחה שמתח הסף הוא 0.2 volts. מדוד את הזמן שנדרש לפוטנציאל להגיע לסף בכל נגד ממברנה.שרטטו את התוצאות שלכם כפונקציה של זמן מול מרחק; עלייה בעובי נרתיק המיאלין גורמת לירידה בקיבול הממברנה. דמו זאת על ידי החלפת קבלי ה-10 micro ferd על לוח הבדיקה (breadboard) בקבלי 0.1 micro ferd קטנים יותר. חזרו על הניסוי הקודם.שימו לב לשינוי בזמן להגעה לסף בנגד נבחר. ה superimposed את הנתונים עם הקבלים הגדולים יותר על הגרף הקודם של זמן לעומת מרחק. הגדלת עובי נבקי המיאלין מאפשרת לאותות חשמליים לעלות ולרדת במהירות רבה יותר בתא עצב, ובכך מגבירה את מהירות ההולכה.בחלקו הבא של הניסוי, ייבחנו התכונות האלקטרוכימיות של אקסונים בחוט העצבי הגחוני (ventral nerve cord) של סרטן נחל. תכונות הפריסה הפסיבית של זרם המוצגות במעגלי המודל נצפות גם בהכנות חיות. עם זאת, נדרש פוטנציאל פעולה בכל פעם שיש להעביר אות למרחק של מספר מילימטרים, שכן התכונות החשמליות הפסיביות של התאים יגרימו להחלשת האותים לאורך מרחק זה.כאשר אותות נעים לאורך חוט העצבים הגבי (ventral nerve cord) של סרטון ב السرטנים במהירויות הולכה שונות, האותות המהירים ביותר יירשמו ראשונים והאיטיים יותר יירשמו מעט מאוחר יותר. חלק מהאותות יסוכמו ברישום, בהתאם לאוכלוסיית האקסונים בעלי מהירויות הולכה דומות. אות חשמלי מסוכם זה, המגיע ממספר אקסונים, מכונה פוטנציאל פעולה מורכב (compound action potential).סדרת הניסויים הבאה מתמקדת בהקלטת פוטנציאלי פעולה מורכבים מעצבי סרטן נחל, על מנת להשיג את חוט העצבים הגבי (ventral nerve cord) של סרטן הנחל. ראשית, הכינו את כלי הניתוח עבור צלחת העצבים ואת תמיסות המלח. הניחו את סרטן הנחל על קרח למשך כחמש דקות כדי להרדימו.לאחר ההרדמה, עטפו את הסרטן במגבת נייר לחה והחזיקו אותו ביד אחת כאשר הצבתים נמצאים בין האגודל לאצבע המורה. באמצעות היד השנייה, בצעו חתך עם המספריים דרך ה-rostrum בין שקעי העיניים. גזרו כלפי מטה מהחתך עד להפרדה מלאה של הראש.הסר את הצבתים ואת רגלי ההליכה. בצע חתך בבסיס ה-cephalic thax מעל הבטן והפרד את ה-cephalic thax. הסר את הזנב ואת סנפירי השחייה.בצעו חתך לאורך שני צדי הצד הבטני של הבטן. היזהרו לא לפגוע ברקמות עמוקות יותר. קלפו לאחור את חלק השלד החיצוני ששוחרר עד לבסיס מניפת הזנב כדי לחשוף את השרשרת העצבית הבטנית.השתמשו בקצה הפינצטה כדי להסיר בזהירות את חבל העצבים הגבי (ventral nerve cord) מהקצה. היזהרו לא למתוח או למעוך את חבל העצבים. כל בליטה הנצפית על חבל העצבים היא גנגליון של סרטן נחל.הניחו את חוט העצבים על פסי המתכת בתא העצבים. חיוני לשמור על חוט העצבים הוונטרלי לחות. כדי להשיג זאת, הוסיפו לתא העצבים מספיק תמיסת סליין של סרטן נחל עד לגובה פסי המתכת.בשלב הבא, שאבו באמצעות פיפט מספיק ממסלול המלח של הסרטן כך שגובה הנוזל יגעה בדיוק בתחתית המוטות. לאחר שהחוט העצבי ממוקם, חברו את כבל המעורר בעל שתי אלקטרודות התלייה (mini hook leads) לתא העצב. חברו את האלקטרודה האדומה החיובית לאחד הלולאות המתכתיות החיצוניות סמוך לקצה החוט העצבי, וחברו את האלקטרודה השחורה השלילית ללולאה המתכתית הסמוכה שנמצאת גם היא במגע עם החוט העצבי.השתמש במניפולטור כדי למקם את אלקטרודת השאיבה ליד קצה העצב, בכיוון הנגדי למוצרי השלילי והחיובי. שאב בזהירות את קצה השרוך העצבי הבטני (ventral nerve cord) אל תוך אלקטרודת ההקלטה. חבר את האלקטרודה לגשש של שלב הראש (head stage probe) על ידי חיבור חוט אחד מאלקטרודת השאיבה לכניסה החיובית של הגשש והחוט השני לכניסה השלילית.אין חשיבות לשאלה איזה חוט מחובר לאיזה כניסה. ניתן להביא את הפרובה להארקה באמצעות חוט כסף-כלוריד למבנה פאראדיי או לאמבט המלח, או לחבר אותה לכניסת ההארקה במגבר הדיפרנציאלי כדי להפחית רעשי רקע של 60 hertz. חברו את הפרובה למגבר הדיפרנציאלי ואת המגבר ל-power lab.בדקו שההגדרות עבור המגבר RS תואמות למוצגות בטבלה במאמר הנלווה. השתמשו בכבל ה-USB כדי לחבר את ה-power lab למחשב. פתחו את תוכנת ה-scope משולחן העבודה של המחשב, בפינה הימנית העליונה של המסך.בחר בערוץ שתיים וכבה אותו. כוונן את המסך כך שרק ערוץ אחת יוצג, על ידי גרירת הסרגל שבמרכז לתחתית המסך. בדוק את מגבר הכניסה בהתאם להגדרות המופיעות במאמר המצורף.לאחר מכן, תחת הגדרות (setup) בחלק העליון של המסך, בחרו בגירוי (stimulator), כבו את אפשרות ה-isolated stem והגדירו השהיה (delay) של 5 milliseconds, משך (duration) של 1 millisecond, שני פולסים, מרווח (interval) של 15 milliseconds, טווח של 5 volts ואמפליטודה של 0.5 volts. כדי להתחיל בגירוי של שרשרת העצבים הבטנית (ventral nerve cord), לחצו על כפתור ההפעלה (start) בפינה השמאלית התחתונה של המסך. פוטנציאל פעולה מוגדר בבירור אמור להופיע בתיבת איסוף הנתונים של האוסצילוסקופ.שרטטו במחברת את הצורה הכללית של פוטנציאל הפעולה. הפחיתו את המתח באיטיות באמצעות הלשונית בפינה השמאלית העליונה של המסך. עוצמתו של פוטנציאל הפעולה צריכה להצטמצם עד שדפוס הגל האופייני שלו ייעלם.הפחתת המתח מקטינה את מספר הנוירונים שגויסו כדי לתרום לפוטנציאל הפעולה המורכב; כדי להפוך את ההשפעה, הגבירו את המתח באופן הדרגתי. ככל שגויסו יותר נוירונים, גל פוטנציאל הפעולה המורכב גדל. תרגיל זה ממחיש את העובדה שלנוירונים בודדים יש ספי thresholds שונים שבהם נגזרים פוטנציאלי הפעולה שלהם.כאשר עלייה נוספת במתח הגירוי אינה מגבירה את פוטנציאל הפעולה המשולב, משמעותו היא שכל הנוירונים גויסו ושני שיאים נבדלים בגל פוטנציאל הפעולה אמורים להופיע על מסך המחשב. חלקו הבא של הניסוי בוחן את תקופת ה refractory של האקסונים. שנו את ההשהיה בין הפולסים באמצעות הלשונית בפינה השמאלית העליונה של המסך.המשיכו לקצר את ההשהיה עד שלא ניתן יהיה לעורר פוטנציאל פעולה שני בתרכובת. תקופת ה refractory המוחלטת מוגדרת כהשהיית הזמן בין הפולסים שבה לא ניתן לעורר יותר פוטנציאל פעולה שני. תקופת ה refractory היחסית מוגדרת כהזמן מסוף תקופת ה refractory המוחלטת ועד לזמן שבו מתן גירוי שני גורם לפוטנציאל פעולה שני בעוצמה מלאה.כעת ניתן לחקור את תכונותיו של מעכב צומתי פער (gap junction inhibitor) כגון hept ethanol. ניתן להשוות את ההבדלים בפוטנציאל הפעולה המורכב עבור אותן הגדרות גרייה, כדי לקבוע אילו אותות מועברים באמצעות צומתי פער לאורך חוט העצבים הבטני (ventral nerve cord). ניתן להשתמש גם בתמיסת מלח (saline) קרה או חמה ולמדוד הבדלים במהירויות ההולכה של הישויות השונות המרכיבות את פוטנציאל הפעולה המורכב.מוצגים כאן שני פוטנציאלי פעולה מורכבים שהוקלטו משרוך העצבים הגבאי (ventral nerve cord) של סרטן נהר. איור זה ממחיש את תקופת הסירוב היחסית, שהיא הזמן החולף לאחר פוטנציאל פעולה מורכב מלא, שבו גירוי שני מעורר פוטנציאל פעולה מורכב קטן יותר. איור זה מראה את ההשפעות של שימוש ב-hept ethanol על פוטנציאל הפעולה המורכב בעקבות הליך זה.ניתן לשנות את רכיבי מעגל הממברנה הביולוגית כדי לענות על שאלות נוספות, כגון השפעתה של צפיפות משתנה של תעלות דליפה בממברנה או תפקודן של תעלות תלויות-מתח לאחר פיתוחן. טכניקות והליכים אלו סוללים את הדרך עבור חוקרים בתחום הפיזיולוגיה לבחון כיצד תאים מתפקדים כמעגלים חשמליים וכיצד צמתי פער (gap junctions) מתפקדים ברקמה חיה בבעלי חיים.

modeling-biological-membranes-with-circuit-boards-measuring

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

חלבון ממברנה פונקציה מוסדר על ידי הרכב קרום התא השומנים. זה וידאו המאמר מפרט כיצד ליצור תיקון באמצעות אלקטרודות תיקון bilayer, כמו גם כיצד להשתמש ערוצי gramicidin כמו כתבים של תכונות הממברנה משתנה.

שיטות מולקולה בודדת עבור ניטור שינויים ב bilayer תכונות אלסטיות

Bilayers השומנים מישורי, הנקרא גם bilayers השומנים מלאכותית, מאפשרים לך ללמוד ניצוח יון ערוצי בסביבה מוגדרת היטב. הנה, אנחנו מדגימים את השלבים הפרט צריך להכין את החדר bilayer, האלקטרודות וכיצד הבדיקה bilayer מתאים ערוץ בודד במדידות.

הכנת Bilayers מלאכותית לניסויים Electrophysiology

אנו מדגימים כיצד ללמוד את ההשפעה של מוטציה נקודה אחת על התפקוד של ערוץ יון.

Mutagenesis וניתוח פונקציונלי של תעלות יונים הביעו Heterologously בתאי יונקים

הניסויים להפגין גישה נוחה לסטודנטים לצבור ניסיון לבחינת מבנה השריר, תגובות הסינפטי, את ההשפעות של הדרגתיים יונים חדירות על פוטנציאל הממברנה. כמו כן, חושית-CNS-מנוע שריר מעגל מוצג להראות אמצעי לבחון השפעות של חומרים במעגל עצבי.

ממברנה פוטנציאלים, התגובות Synaptic, המעגלים הנוירונים, Neuromodulation ו היסטולוגיה שרירים שימוש סרטן הנהרות: מעבדה תרגילים סטודנטים

פרוטוקולי לולאה סגורה הופכים נפוצים יותר ויותר באלקטרופיזיולוגיה המודרנית. אנו מציגים דרך פשוטה, רב-תכליתית וזולה לביצוע פרוטוקולים אלקטרופיזיולוגיים מורכבים בנוירונים פירמידליים בקליפת המוח במבחנה, באמצעות מחשב שולחני ולוח רכישה דיגיטלי.

אלקטרופיזיולוגיה בזמן אמת: שימוש בפרוטוקולי לולאה סגורה לDynamics עצבי בדיקה ומעבר

במאמר זה מוצגת מסגרת ניסויית לביצוע ניסויים בלולאה סגורה, בה נלמדים עיבוד מידע (כלומר, קידוד ופענוח) ולמידה של מכלולים עצביים במהלך האינטראקציה המתמשכת עם גוף רובוטי.

ניסויי נוירו-רובוטית לולאה סגורה כדי לבדוק את מאפיינים חישובית של רשתות עצבי

טכניקות מיקרוסקופ אור בשילוב עם מבחנים ביוכימיים מבהירים את המעורבות של אקסוציטוזיס בתיווך SNARE בהסתעפות אקסונים תלויי נטרין. שילוב טכניקות זה מאפשר זיהוי של מנגנונים מולקולריים השולטים בהסתעפות האקסון ובשינוי צורת התא.

ניצול מתודולוגיות משולב להגדיר את התפקיד של משלוח ממברנה פלזמה במהלך אקסון מסעף ו העצבית המורפוגנזה

פרוטוקול זה מטרתו להדגים כיצד לשלב במבחנה microelectrode מערכים להתקנים microfluidic לימוד פוטנציאל הפעולה שידור בתרבויות עצביים. ניתוח נתונים, כלומר זיהוי ואפיון של הפצת פוטנציאל פעולה, הוא שבוצעו באמצעות חדש מתקדם, אך ידידותי למשתמש, זמינה בחופשיות, כלי חישובית.

התממשקות מיקרופלואידיקה עם מערכים Microelectrode ללמוד תקשורת עצביים והתפשטות אות עצב

רכים, צריכת חשמל נמוכה, memristors למערכות ביולוגיות ממנפים קומפוזיציה דומה המבנה, החלפת מנגנונים של ביו-הסינפסות. המוצג כאן פרוטוקול כדי להרכיב או לאפיין למערכות ביולוגיות memristors מתקבל בידוד השומנים bilayers בין טיפות מים בשמן. שילוב של פפטידים מופעל מתח alamethicin תוצאות מוליכות יונית memristive על פני הקרום.

הרכבה ואפיון של Memristors למערכות ביולוגיות המורכב ממברנות השומנים מסטול-תעלת יונים

אנו מסכמים זרימת עבודה כדי ליצור מודלים חישוביים של התנהגויות של נוירון רשתית בתגובה לגירוי חשמלי. המודל החישובי הוא רב-תכליתי וכולל שלבי אוטומציה שימושיים בהדמיית מגוון תרחישים פיזיולוגיים ובחיזוי התוצאות של מחקרי in vivo/in vitro עתידיים.

מידול חישובי של נוירוני רשתית לחקר תותבות חזותיות - גישות בסיסיות

מוצג פרוטוקול ניסיוני להרכבה, גירוי חשמלי וניתוח דו-שכבתיות מממשק טיפות עם גרמיצידין A. יחסי מבנה-תפקוד בין ליפידים לחלבון נמדדים על ידי מדידת שינויים בשטח הממברנה, בזרם יוני ובהולכה חד-ערוצית, וקישור תגובות אלו לשינויים דמויי פלסטיות בהולכה יונית במודל ממברנה בהשראת סינפסות חשמליות.

אפיון מבנה תפקוד ממברנת ליפידים-חלבון באמצעות דו-שכבות ממשק טיפות

למדו מודלים חשמליים של ממברנות ביולוגיות באמצעות מעגלים מודדים ורשומות פוטנציאלי פעולה מחוט העצב הגבי של סרטן הנהרות. שיטה זו מספקת ניסיון מעשי בחקר פיזיולוגיה עצבית.

דוגמנות ממברנות ביולוגיות עם מעגלים מדידת אותות חשמליים בתוך האקסונים: מעבדה תרגילים סטודנטים

גלה סרטונים נוספים