Name: קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: למד לקבוע את מצב המתילציה של DNA בגנים מוטבעים באנדוספרם של Arabidopsis. שיטה זו משתמשת ברצף ביסולפיט כדי לחקור מנגנוני הדפסה גנטית בצמחים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לגב &#39;ג&#39;ניפר מ Lommel וטרה נ Rognan לצורך תחזוקה של צמחי ארבידופסיס. עבודה זו נתמכה על ידי סטארט כספים אוניברסיטת סנט לואיס ו - National Institutes of Health מענקים 1R15GM086846-01 ו-01S1 3R15GM086846 אל שיאו וו.

I. גנטיות מעבר 1. מסרס ההורה הנקבי כדי להבחין בין אללים אימהי ואבהי באמצעות רצף ה-DNA פולימורפיזם, שני ecotypes שונים, כגון קולומביה-0 (Col-0) ו הימלר, ייבחרו כהורים הנשית והגברית. הצמחים צריכים להיות צעירים ובריאים. אפשר לסרס ההורה הנקבי באמצעות מיקרוסקופ לנתח, מגדלת מגן, או בעין בלתי מזוינת. אתר הבמה 12 פרחים (סמית. Et al 1990) והסר פרחים או siliques מעל ומתחת להם על ידי חיתוך הבסיס של pedicel עם המספריים. לעקר מלקחיים על ידי טבילה הבסיס של קצה בעדינות לתוך מבחנה של אתנול 95%, אשר תסיר את כל גרגרי אבקה על מלקחיים ולהרוג את האבקה גם כן. לחטט בעדינות לגזרים את ניצני פרחים באמצעות מלקחיים, להסיר בעדינות 4 עלי גביע, 4 עלי כותרת, ו -6 אבקנים, עוזב פיסטיל החשוף ללא פגע. נסו להימנע נזק carpels במהלך תהליך זה. 2. בחירת התורם אבקה וביצוע ההאבקה התורמים הטובים ביותר הם אבקה anthesed פרחים לפתוח בשלב 14 עם עלי הכותרת הארכת בזווית של 90 מעלות על פיסטיל (סמית. Et al 1990), שבו הרבה אבקה היא לשפוך. תפוס את פרח בבסיס בדיוק מעל pedicel, אשר תגרום לפרח להפיץ פתוח. אבק את הסטיגמה של פיסטיל הכינו עם מאבק. לאחר ההאבקה, הסטיגמה יהיה מכוסה אבקה צהובה, אשר ניתן לצפות בקלות תחת מיקרוסקופ. 3. סימון הצלב לאחר מאביקים כל עליים מסורס על צמח, ומתייגים את הצלב עם תג תכשיטים מידע להורים הנשית והגברית ותאריך. המקום יתד באדמה קרוב הצמח, להשתמש במחרוזת לקשור את גזע של תפרחת אל המוקד, ולכסות את עליים pollinated עם שקית פלסטיק. השנייה. בידוד של רקמות האנדוספרם של ארבידופסיס 1. הכנת חומרים בדרך כלל אנחנו מקבלים חומרים הדרושים מוכן לפני קצירת האנדוספרם ורקמות העובר: מיכל חנקן נוזלי, חנקן נוזלי, מיקרוסקופ לנתח, שני זוגות חדשים של עדין קצה מלקחיים (5 Inox FST ידי דומון ביולוגיה, שוויץ.) זכוכית שקופיות מיקרוסקופ ( 3 "X 1" X 1.0 מ"מ), 5.7 pH פתרון של M 0.3 ו - 5 מ"מ סורביטול MES. 2. איסוף siliques ב - 7 או 8-יום לאחר ההאבקה-(DAP), זרעים מוכנים להיות שנקטפו על אמצע לטרפד לשלב מאוחר של העובר ואת גזור עבור האנדוספרם ואת העובר. לפעמים, זה עלול לקחת 9-10 DAP אם הפרחים מסורס צעירים מדי. 3. האנדוספרם בידוד העובר מאז זרעי ארבידופסיס זעירים, אנו משתמשים במיקרוסקופ לנתח לבודד האנדוספרם ואת העובר. שים silique 8-DAP תחת מיקרוסקופ, להשתמש זוג מלקחיים להחזיק את pedicel silique ולהשתמש קצה זוג נוסף של מלקחיים להחליק silique לפתוח את בשוליים שבו השניים מתמזגים carpels. השתמש זוג מלקחיים לאסוף זרע אחד על 5.7 פתרונות ה-pH של 0.3 M ו - 5 מ"מ סורביטול MES, לעשות חתך קטן בסוף micropyle להחליק את העובר, לסחוט את הסוף חתוכים לדחוף את האנדוספרם ו האנדוספרם נפרד מן המעיל זרע (Kinoshita et al. 2004). שים את העובר לתוך האנדוספרם microtubes נפרד חנקן נוזלי. המשך עד שאנחנו צוברים העובר או האנדוספרם 10-15 siliques ולאחר מכן לאחסן את הצינורית למקפיא -80 מעלות צלזיוס. במקרים מסוימים, האנדוספרם לא צריך להפריד את המעיל זרע, כלומר, אפשר לבודד RNA הכולל האנדוספרם ואת מעיל תערובת זרעי לניתוח החתמה גן. ג. Bisulfite סידור 1. חובה ריאגנטים אמוניום ברומיד Cetyltrimethyl (CTAB) להכנת דנ"א גנומי, אנזימי הגבלה, 3 M NaOH (טריים), 6.42 מ 'אוריאה / 4 bisulfite M נתרן (2 metabisulfite M נתרן, סיגמא אולדריץ, S9000, Na2S2O5, מולקולרית משקל: 190), הידרוקינון 10 מ"מ, ערכת טיהור דנ"א (DNA Promega אשף לנקות מערכת, חתול. # A7280), TE חיץ, 6.3 M NaOH (טריים), 10 מ NH 4 OAc, 20 מיקרוגרם / tRNA μL, אתנול ו - 100% . 2. פרטי פרוטוקול הטיפול bisulfite <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> האנדוספרם או לבודד DNA גנומי העובר באמצעות הליך CTAB (רוג'רס Bendich, 1988). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקציר 100 ננוגרם - 2 מיקרוגרם של ה-DNA הגנומי של μL 20-100 בנפח כולל μL עם אנזימי הגבלה, כי לחתוך מחוץ לאזור כדי להיות מנותח. עבור האמרגן MEA, אנו משתמשים XhoI, NdeI ו PstI או HindIII. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפגל אנזימי הגבלה על ידי ה-DNA רותחים במשך חמש דקות ואז להרוות על הקרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים 1 / 9 נפח (2.2 μL עבור DNA 20 מתעכל μL) של 3 M NaOH ו לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הפתרון צינור 250 PCR μL. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמיס 7.5 גרם של אוריאה ב 10 מ"ל של מים מזוקקים סטריליים; לאט להוסיף 7.6 גרם נתרן metabisulfite מעל 1-2 שעות חימום בדרך כלל עוזר המסת; התאם את ה-pH ל 5 עם טריים 10 M NaOH, הוסף מים מזוקקים סטריליים על סופי נפח מ"ל 20. זוהי 6.24 אוריאה ז / 4 bisulfite M פתרון נתרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 6.24 אוריאה ז / 4 bisulfite M נתרן פתרון ריכוז סופי של 5.36 מ 'ו 3.44 מ', בהתאמה (Paulin et al., 1998). לדוגמה, להוסיף 208 μL של אוריאה 6.42 M / M 4 bisulfite נתרן פתרון μL 22.2 לעיל של הדנ"א הגנומי מפוגל (שיאו et al., 2003). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף הידרוקינון 10 mM ל-DNA בריכוז סופי של 0.5 מ"מ (12 μL לעיכול 20 μL). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התנהגות טיפול bisulfite במכונה PCR: 30 מחזורים של 55 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ו 95 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desalt את ה-DNA bisulfite שטופלו באמצעות מערכת לנקות אשף דנ"א Promega ומעקב פרוטוקול (ג'ייקובסן et al., 2000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את נפח המדויק של TE התאושש הטור לאחר desalting ולהוסיף 6.3 M NaOH ריכוז סופי של 0.3 מ 'לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 M NH 4 OAc (pH 7.0) לריכוז סופי של M 3, 2 μL של 20 מיקרוגרם / tRNA μL, 3 כרכים של 100% אתנול ואז לערבב. צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 14,000 סל"ד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטפו את הכדור פעם אחת עם 70% אתנול, לעשות צנטריפוגה קצר, ולהסיר אתנול נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יבש גלולה ב speedvac למשך 5-10 דקות ו resuspend ב 25-100 μL חיץ TE בהתאם החל כמות ה-DNA. נתרן bisulfite שטופלו DNA עכשיו הוא מוכן לניתוח PCR. </li></ol> 3. PCR הגברה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאז cytosines unmethylated מומרים אורציל, קשה כדי להגביר ושבר גדול באמצעות DNA bisulfite שטופלו כתבנית. לפיכך, אנו בדרך כלל עיצוב primers להגביר מוצר לא יותר מ 500 נ"ב. רצף האמרגן 4-kb MEA, עיצבנו קבוצות רבות של primers ואת מוגבר 14 שברים חופפים כדי לכסות את האזור כולו (שיאו et al., 2003). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי רצף העליונה גדיל, בעיצוב פריימר קדימה, אני) לבחור (G גואנין) עשיר באזור על מנת להיות חישול בטמפרטורה גבוהה ללא נוקלאוטידים ארוך במיוחד של primers; II) לשנות C (ציטוזין) ל-Y ( פירימידין) בשעה CG והקשרים CNG ולשנות את C הנותרים T (תימין). בעיצוב פריימר הפוכה, אני) בוחר אזור C עשיר; II) לשנות את G R (purine) בשעה CG והקשרים CNG ולשנות את G הנותרים A (אדנין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רצף התחתונה גדיל, בעיצוב פריימר קדימה, אני) בוחר אזור C עשיר; II) לשנות את G R ב CG והקשרים CNG ולשנות את G הנותרים א בעיצוב פריימר הפוכה, אני) לבחור אזור ה-G-עשיר; II) לשנות את C ל-Y (פירימידין) בשעה CG והקשרים CNG ולשנות את C הנותרים ט </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אנחנו בדרך כלל להשתמש 1-2 μL של ה-DNA נתרן bisulfite שטופלו כתבנית הגברה כל PCR (שיאו et al., 2003). מוצר ה-PCR צריך להיות מנותח על ידי אלקטרופורזה בג'ל על מנת לאשר את הגודל הנכון של שבר, ולאחר מכן להיות מטוהרים ג'ל משובטים לתוך ת"א Topo שיבוט וקטור pCR2.1 (Invitrogen) כמו להוסיף. מושבת יחיד הרים ותרבותיים; DNA פלסמיד חילוץ ושלח עבור סידור. </li></ol> 4. רצף ניתוח העיקרון של רצף bisulfite היא ציטוסין unmethylated יומרו אורציל בשל deamination hydrolytic על ידי ריכוז גבוה של bisulfite נתרן ב pH5.0 אשר יהיה מוגבר כמו תימין במוצר ה-PCR, בעוד 5-מתיל ציטוזין לא יהיה שונה על ידי bisulfite נתרן ולהישאר להיות ציטוזין לאחר הגברה PCR (Clark et al, 1994;. פרומר et al, 1992).. לאחר השגת התוצאה ריצוף, נשווה את זה עם תבנית גדיל ספציפי המשמש הגברה PCR. אם שאריות ציטוסין בתבנית קורא כמו תימין בתוצאה רצף, מעידה על כך ציטוסין אינו מפוגל. אם שאריות ציטוסין בתבנית נשאר ציטוסין ב רצף, זה אומר כי ציטוסין הוא מפוגל. IV. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2327/2327fig1.jpg" alt="איור 1 /" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1 /"> באיור 1.

<ol><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li>
<li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li>
<li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li>
<li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li>
<li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li>
<li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5%27-+methylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li>
<li>Rogers, S. O., &amp, B. endich, J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Manual%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Flower+Development+in+Arab%C3%ADdopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early Flower Development in Arabídopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

קל יחסית להפריד העובר מן האנדוספרם ואת המעיל זרע, אבל זה משעמם להפריד האנדוספרם מן המעיל זרע, במיוחד עבור זרע בשלב מוקדם או אמצע לטרפד של העובר. מאז מעיל הזרע רק תורם כמות קטנה מאוד של רקמה, עבור גנים מסוימים, למשל, MEA ו FWA, אין לנו להפריד את האנדוספרם מן המעיל זרע. כלומר, אנחנו יכולים לבודד RNAs מתערובת של האנדוספרם ומעיל רקמות זרע, לבדוק ביטוי של אללים אימהי ואבהי של הגן, להשוות עם ביטוי בעובר, ולקבוע את מעמד ההחתמה של הגן. <p class="jove_content" style="...

ספקי <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הביתור מיקרוסקופ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מספרים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצה מלקחיים פיין </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תכשיטים תגית </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצמח תחרות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחרוזת או טוויסט-Ties </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 &quot;X 2&quot; X 8 &quot;שקיות פוליאתילן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 &quot;X 1&quot; X מיקרוסקופ שקופיות 1.0 מ&quot;מ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנקן נוזלי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיכלי חנקן נוזלי </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מחממים חסום </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנורות ה-PCR </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Thermocycler </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microcentrifuge צינורות </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ג&#39;ל אלקטרופורזה מתקן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבידופסיס thaliana קולומביה-0 צמחים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבידופסיס thaliana לנדסברג erecta צמחים </li></ul> ריאגנטים <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 95% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.3 מ סורביטול ו 5 מ&quot;מ MES-pH 5.7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אמוניום ברומיד Cetyltrimethyl (CTAB) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100% אתנול </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cholorform </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגבלת אנזימים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 M NaOH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6.3 M NaOH </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6.24 מ &#39;דשן / 4 bisulfite M נתרן </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סטרילי מזוקקים H 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 mM הידרוקינון </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אשף ה-DNA לנקות מערכת (Promega) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 מ NH 4 OAc </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 מיקרוגרם / tRNA μL </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TE חיץ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדד ת&quot;א Topo שיבוט Kit (Invitrogen) </li></ul>

קביעת מתילציה dna של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

Thaliana ארבידופסיס הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר מנגנוני epigenetic. אחת הסיבות היא מוטציה הפסד-of-null פונקציה של methyltransferases DNA היא בת קיימא, ובכך לספק מערכת ללמוד איך הפסד של מתילציה DNA בגנום משפיע על הגדילה וההתפתחות. החתמה מתייחס הביטוי ההפרש של אללים אימהי ואבהי ובעל תפקיד חשוב בהתפתחות רבייה הן יונקים וצמחים. מתילציה DNA הוא קריטי לקביעת אם אללים אימהי או אבהי של הגן המוטבע מבוטא או מושתק. בשנת צמחים פורחים, יש אירוע הפריה כפולה רפרודוקציה: תא הזרע מפרה את הביצית ליצירת העובר ואת הנתיכים הזרע השני עם תא מרכזי להצמיח האנדוספרם. האנדוספרם היא הרקמה בה החתמה מתרחשת בצמחים. MEDEA, תחום SET גן Polycomb הקבוצה, FWA, גורם שעתוק ויסות פריחה, הם הראשונים שני גנים הראו להיות טבועה האנדוספרם והביטוי שלהם נשלטת על ידי מתילציה של דנ&quot;א demethylation צמחים. על מנת לקבוע את מעמדם החתמה של גן דפוס המתילציה של האנדוספרם, אנחנו צריכים להיות מסוגלים לבודד את האנדוספרם הראשון. מאז הוא זרע זעיר ארבידופסיס, הוא נותר מאתגר לבודד את האנדוספרם ארבידופסיס ולבחון מתילציה שלה. בפרוטוקול זה וידאו, אנו מדווחים איך לנהל את צלב גנטית, לבודד רקמת האנדוספרם מזרעים, כדי לקבוע את מצב המתילציה על ידי רצף bisulfite.

החתמה היא תופעה במפעל ורבייה יונק. מתילציה DNA ממלא תפקיד חשוב במנגנוני של הטבעה. האנדוספרם בידוד וקביעת מעמד מתילציה של גנים מוטבעים<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; יכול להיות קשה. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד את האנדוספרם ולקבוע מתילציה של רצפי bisulfite.

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

.Arabidopsis thaliana הוא אורגניזם מודל מצוין לחקר מנגנונים אפיגנטיים. אחת הסיבות לכך היא המוטציה השורית (null mutant) של אובדן תפקוד של ה-DNA...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא לקבוע את מצב מתילציית ה-DNA של גנים בעלי טביעה (imprinted genes) באנדוספרמה. הדבר משיג תחילה על ידי סירוס (emasculation) של ההורה הנקבי. לאחר מכן, ההורה הנקבי מופחית באבקה של ההורה הזכרי.בשלב הבא, מוציאים את האנדוספרמה מהזרע שהפריה בצורה צולבת. השלב האחרון של הפרוצדורה הוא ביצוע ריצוף ביסולפיט של ה-DNA של האנדוספרמה. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את מצב מתילציה של ה-DNA של האלל האימהי או האביי של גן בעל טביעה (imprinted gene) באמצעות פולימורפיזם של ריצוף DNA באקוטיפים שונים וריצוף ביסולפיט.שלום, אני ד"ר Yang Shaw מהמחלקה לביולוגיה באוניברסיטת St.Louis. שלום, אני Matthew Ray מהמעבדה של ד"ר J והמחלקה לביולוגיה באוניברסיטת St.Louis. אני Diman Panu מהמעבדה של ד"ר J.היום נדגים לכם הליך לביצוע דיסקציה של rugby officer וקביעת מצב מתילציה של DNA באמצעות רצף sulf FAR. אנו משתמשים בהליך זה במעבדה שלנו כדי לחקור הטבעה גנטית (gene imprinting) המהווסתת על ידי מתילציה ודמתילציה של DNA. אז בואו נתחיל.כדי להתחיל בהליך זה, בחרו שני אקוטיפים שונים של Arabidopsis שישמשו כהורים נקבה וזכר, במטרה להבדיל בין האללים האימהיים לפטרנליים באמצעות פולימורפיזם של רצפי DNA. במקרה זה, נבחרו Columbia zero ו-Landsberg Erecta כהורה נקבה וזכר בהתאמה. הקפידו לבחור צמחים צעירים ובריאים.בצע סירוס לצמח האם באמצעות מיקרוסקופ סטריאוסקופ(dissecting microscope). אתר פרחים בשלב 12 והסר כל פרח או LICs שמעליהם או מתחתיהם על ידי גזירת בסיס התושבת עם מספריים. עקם את הפינצטה על ידי טבילה עדינה של קצה החוד בביקר עם 95%ethanol.פעולה זו תסיר גרגירי פולן כלשהם מהפינצטה ותהרוג את הפולן. פתחו בעדינות את ניצני הפרח באמצעות פינצטה והסירו בזהירות ארבעה גבנועים, ארבעה עלי כותרת ושש אstamens, כך שהעלילה תישאר חשופה ושלמה. השתדלו להימנע מפגיעה בשחלאים במהלך תהליך זה.השלב הבא הוא בחירת תורם האבקה וביצוע ההאבקה. תורמי האבקה הטובים ביותר הם הפרחים הפתוחים בשלב 14, כאשר העלי כותרת בולטים בזווית של 90 מעלות לעומת העלי השומת, ובהם נשפכת כמות רבה של אבקה. תפסו את הפרח בבסיסו ומעל הגביע, פעולה שתגרום לפרח להיפתח. הפילו אבקה מהאבקנים על הסטיגמה של העלי השומת שהוכנו.לאחר ההאבקה, הסטיגמה תהיה מכוסה באבקה צהובה, אותה ניתן להבחין בקלות תחת מיקרוסקופ. לאחר האבקת כל השחלאים שסורסו בצמח, סמנו את ההכלאה באמצעות תג תכשיטים. ציינו את התאריך ואת פרטי ההורים הנקבה והזכר.הנעץ מוט בקרקע קרוב לצמח. השתמש בחוט כדי לקשור את גבעול הפרח למוט וכסה את העלי השמעת (pistils) שהופרו בשקית פלסטיק. שבעה או שמונה ימים לאחר ההאבקה (DAP), הזרע אמור להיות מוכן לקציר בשלב הטורפדו התיכון עד המאוחר של האמבריוגנזה ולביצוע נתיחה.עבור האנדוספרם והעובר, הניחו פריה של salic בתג 8 DAP תחת מיקרוסקופ dissecting. באמצעות פינצטה, אחזו בתא EK P והשתמשו בקצה של פינצטה נוספת כדי להסיר את הפתח בשוליים שבהם שני הגביעים מתאחים. השתמשו ב-BPS כדי לאסוף זרע אחד ולהניחו על תבנית זכוכית.לאחר מכן, בצעו חתך קטן בקצה של המיקרו-ערימה (micro pile) כדי להחליק החוצה את העובר. לחצו על הקצה שלא נחתך כדי לדחוף החוצה את האנדוספרם ולהפרידו מקליפת הזרע. לאחר מכן, העבירו את העובר ואת האנדוספרם למיקרו-מבחנות נפרדות ולחנקן נוזלי.המשיכו כך עד להצטברות מספקת של עובר או אנדוספרמה מ-10 עד 15 CLICs. לאחר מכן, אחסנו את המבחנות במקפיא של 80- מעלות צלזיוס לפני הטיפול בביסולפיט. בודדו DNA גנומי של אנדוספרמה או עובר באמצעות פרוצדורת trimethyl ammonium bromide או CTAB עדינה.לאחר בידוד ה-DNA הגנומי מהאנדוספרם, בצע עיכול של 100 nanograms בנפח תגובה כולל של 20 microliter באמצעות אנזימי הגבלה שחותכים מחוץ לאזור המיועד לניתוח. עבור הקידוד של ה-ME promoter, נעשה שימוש באנזימי ההגבלה xh, O one ND one ו-PST one. דנאטורציה של אנזימי ההגבלה תבוצע על ידי הרתחת ה-DNA למשך חמש דקות.לאחר מכן, עצרו את התגובה על קרח. הוסיפו נפח של תשעית או 2.2 µL של sodium hydroxide בריכוז 3 M והדגירו בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר ההדגרה, העבירו את התמיסה למבחנה עבור PCR בנפח של 250 µL.בשלב הבא, הכינו תמיסת urea בריכוז 6.24 M ו-sodium metabisulfite בריכוז 4 M על ידי המסת 7.5 גרם של urea ב-10 מיליליטר של מים מזוקקים סטריליים, תוך הוספה איטית של 7.6 גרם sodium metabisulfite לאורך שעה עד שעתיים בזמן שהתמיסה מחוממת ומערבבת. לאחר ההמסה, התאימו את ה-pH ל-5 באמצעות sodium hydroxide בריכוז 10 M שהוכנה טרייה.הוסיפו מים מזוקקים סטריליים עד לנפח סופי של 20 milliliters. העבירו 208 microliters מתמיסה זו ל-22.2 microliters של ה-DNA הגנומי של האנדוספרם שעבר דנטורציה. לאחר מכן, הוסיפו ל-DNA כ-12 microliters של hydroquinone בריכוז 10 millimolar שהוכן טרי.בצע את הטיפול בביסולפיט במכשיר PCR ב-30 מחזורים של 55 degrees Celsius למשך 15 דקות, ולאחריהם 95 degrees Celsius למשך 30 שניות. לאחר מכן, הסר מלחים מה-DNA שעובד בביסולפיט באמצעות מערכת wizard, DNA cleanup מבית Promega. בהתאם להוראות היצרן, מדוד את הנפח המדויק של ה-TE שהושג מהעמודה לאחר הסרת המלחים.לאחר מכן, הוסיפו נתרן הידרוקסיד 6.3 molar עד לריכוז סופי של 0.3 molar. דגרו את התערובת בטמפרטורה של 37 °C למשך 15 דקות. לאחר הדגירה, הוסיפו אמוןיום אצטט 10 molar עד לריכוז סופי של three molar, שני µL של TRNA בריכוז 20 µg/µL ושלושה נפחים של 100% ethanol.ערבבו את הדגימה וסבבו בצנטריפוגה למשך 15 דקות במהירות של 14,000 RPM. שטפו את המשקע פעם אחת ב-70% ethanol, ולאחר מכן סבבו בצנטריפוגה לזמן קצר כדי להסיר את שאריות ה-ethanol. לבסוף, ייבשו את המשקע ב-speed back למשך חמש דקות והשביו אותו לתמיסה ב-25 µL של TE buffer.ה-DNA שעבר טיפול ב-sodium BI cite מוכן כעת לניתוח PCR. כדי לרצף את הקידוד של ה-Madea promoter באורך ארבעה קילו-בסיסים, תכננו מספר סטים של פריימרים והגבירו 14 מקטעים חופפים כדי לכסות את כל האזור. התחילו בתכנון פריימר קדמי (forward primer) לרצף את הגדיל העליון.ראשית, בחרו אזור עשיר בגואנין כדי להשיג טמפרטורת התאבלה (annealing) גבוהה יותר ללא צורך בנוקלאוטידים ארוכים במיוחד בפריימרים. לאחר מכן, שנו ציטוזין לפרימידין בהקשרים של CG ו-C NG. לאחר מכן, שנו כל ציטוזין אחר לתימין.בעת תכנון פריימר הפוך (reverse primer), בחרו אזור עשיר בציטוזין. החליפו גואנין בפורין בהקשר של CG ו-CNG, וכל גואנין אחר לאדנין. כדי לרצף שוב את הגדיל התחתון, התחילו בתכנון פריימר קדמי (forward primer).בחר אזור עשיר בציטוזין והחלף גואנין בפורין בהקשרי CG ו-CNG. החלף את שאר הגואנינים באדנין. בעת תכנון הפריימר ההפוך, בחר אזור עשיר ב-AINE.החליפו ציטוזין בפרדין בהקשרי CG ו-CNG, והחליפו את יתר הציטוזינים בתימין. לאחר תכנון הפריימרים, הכינו תגובת PCR תוך שימוש ב-2 µL של DNA שעבר טיפול בנתרן ביסולפיט כתבנית לכל הגברת PCR. הריצו את תגובת ה-PCR ונתחו את התוצר באמצעות אלקטרופורזה בג'ל כדי לאשש את גודלו הנכון של המקטע.בשלב הבא יש להריץ ג'ל. טהרו את תוצר ה-PCR והכניסו אותו לתוך וקטור השיבוט in vitrogen topo TA cloning vector PCR 2.1. כהכנסה (insert) וריצוף של שיבוטים בודדים, עקרון ריצוף הביסולפיט הוא שציטוזין שאינו ממתיל יעבור המרה לאורציל עקב דהימינציה הידרוליטית על ידי ריכוז גבוה של sodium by sulfite ב-pH 5.0.לעומת זאת, 5-methylcytosine לא יעבור מודיפיקציה על ידי sodium sulfite. Uracil יעוגן כ-thymine בתוצר ה-PCR, בעוד ש-cytosine מתילציה יישאר כ-cytosine לאחר הגברת ה-PCR. לאחר קבלת תוצאות הריצוף, השווה אותן לתבנית הספציפית לגדיל ששימשה להגברת ה-PCR.אם שארית ציטוזין בתבנית מופיעה כתימין בתוצאת הריצוף, הדבר מעיד על כך שהציטוזין אינו מתילated. אם שארית ציטוזין בתבנית נשארת כציטוזין בתוצאת הריצוף, פירוש הדבר הוא שהציטוזין מתילated. מצב המתילציה של אלל MEA אימהי באזור של 500 בסיסים לפני (minus) מקדם ה-MEA עבור חמישה אתרי CPG מתילated בשבטים שרוצפו של Columbia, g Clarus שהכריזו עם endosperm של RLD מוצג; ציטוזינים מתילated מסומנים בעיגולים שחורים מלאים וציטוזינים שאינם מתילated מסומנים בעיגולים לבנים ריקים. באופן דומה, מוצג מצב המתילציה עבור אלל Madea אימהי של Columbia, Gladys שהוכריזו עם עובר של RLD.הרגע הצגנו בפניכם כיצד לבודד אנדוספרמה ולבצע ריצוף סולפיט בעת ביצוע הליך זה. חשוב לזכור להקפיד על ביצוע הפרוטוקול כראוי. וזהו זה.תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

determination-dna-methylation-imprinted-genes-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זרימת עבודה יעילה ללמוד מתילציה דנ"א ביטוי שינויים גנטיים על הלחץ מוקדם בחיים מוצג. החל מ הפרידה מן האם של עכברים בני יומם ובידוד של רקמות מוח נפרדים, אנחנו מייצגים את הפרוטוקול בו זמנית לבודד DNA ו-RNA של אגרופים רקמות המוח רצף bisulfite עתידיים RT-PCR ניתוח.

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

אנו מדווחים שיטה יעילה ופשוטה לבודד את העוברים בשלבים מוקדמים של פיתוח...

בידוד יעיל ומהיר של עוברים משלבים מוקדמים<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em&gt; זרעים

אנו מציגים את ההליך כדי להרכיב assay זרע מצעי מעיל (SCBA) מזרעי thaliana ארבידופסיס. SCBA הוצג להיות כלי רב עוצמה כדי לחקור מבחינה גנטית ובמבחנה כיצד נביטת זרעי פקדי האנדוספרם בזרעים רדומים ובתגובה לאותות אור. SCBA הוא בעיקרון ישים בכל מצב שבו האנדוספרם חשוד להשפיע על צמיחה עוברית.

מעיל זרע מצעים Assay לחקור גנטי<em&gt; במבחנה</em&gt; כיצד נביטת זרעי בקרת האנדוספרם ב<em&gt; Thaliana ארבידופסיס</em

אנו מספקים כאן פרוטוקול יעיל ואמין עבור immunostaining, הקרינה הכלאה באתר, מכתים DNA ואחרי הדמיה בביציות thaliana ארבידופסיס כל הר כמותיים, ברזולוציה גבוהה. שיטה זו השתמשה בהצלחה כדי לנתח שינויי הכרומטין ואדריכלות גרעינית.

שיטה יעילה לניתוח כמותי, תא בודד של הכרומטין שינוי ואדריכלות גרעינית בהר שלם-ביציות ב<em&gt; ארבידופסיס</em

immunoprecipitation הכרומטין הוא טכניקה רבת עוצמה לזיהוי DNA מחייבת אתרים של חלבוני ארבידופסיס in vivo. הליך זה כולל הכרומטין המקשר בין-ופיצול, immunoprecipitation עם נוגדנים נגד סלקטיבית החלבון של עניין, וניתוח qPCR של DNA הקשור. אנו מתארים assay שבב פשוט מותאם לצמחי ארבידופסיס.

הכרומטין immunoprecipitation Assay עבור זיהוי של אינטראקציות החלבון-דנ&quot;א ארבידופסיס<em&gt; In vivo</em

פרוטוקול זה מתאר שיטת התבוננות מופרה ב תודרנית באמצעות סיווג ביצית ואחריו את הבדיקה של היווצרות תבנית העובר תחת מיקרוסקופ.

שיטת אפיון מופרה ב תודרנית

חדשות שהתגלו מחמצנים צורות של 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), 5-carboxylcytosine (5caC) עשוי לייצג שינויים ברורים DNA עם תפקידים פונקציונליים ייחודיים. כאן מתוארת זרימת עבודה כמותית למחצה עבור ויזואליזציה של התפוצה המרחבית של oxi-mCs, פרופיל עוצמת האות ו colocalization.

Immunostaining עבור שינויים DNA: ניתוח חישובית של תמונות קונפוקלי

מבחני האימונו-פסיכוטיציה של ה-RNA המתילציה הם שיטה מבוססת נוגדנים המשמשת להעשרה עבור שברי RNA מתילציה. יחד עם רצף עמוק, זה מוביל לזיהוי של תעתיקים הנושאים את שינוי m5C.

מתילציה RNA אימונואוציאציה Assay ללמוד m5C שינוי ערבידופסיס

המחקר הנוכחי מתאר את זרימת העבודה לניהול נתוני מתילציה DNA המתקבלים על ידי טכנולוגיות microarray. הפרוטוקול מדגים שלבים מהכנה מדגמית לניתוח נתונים. כל ההליכים מתוארים בפירוט, והסרטון מציג את השלבים המשמעותיים.

הכנת מדגם לניתוח ביואינפורמטיקה של מתילציה DNA: אסטרטגיית האגודה להשמנת יתר ומחקרי תכונות נלוות

פרוטוקול זה מתאר הכנת דגימות שלמות של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי Arabidopsis thaliana . השיטה דורשת רק ציוד מעבדה נפוץ, כגון מחט הזרקה ומלקחיים מדויקים, ומאפשרת הדמיה של תאים חיים פלואורסצנטיים ברזולוציה גבוהה של תאי אנדוספרם בזרעים מתפתחים ובוגרים כאחד.

הכנת רקמה שלמה לאנליזה מיקרוסקופית של שכבת תאי האנדוספרם בזרעי ארבידופסיס מתפתחים ובוגרים

למד לקבוע את מצב המתילציה של DNA בגנים מוטבעים באנדוספרם של Arabidopsis. שיטה זו משתמשת ברצף ביסולפיט כדי לחקור מנגנוני הדפסה גנטית בצמחים.

קביעת מתילציה DNA של גנים מוטבעים ארבידופסיס האנדוספרם

גלה סרטונים נוספים