הכנת פרוסות בהיפוקמפוס של חולדות חריפה העכברים הטרנסגניים לחקר שינויים Synaptic במהלך ההזדקנות עמילואיד פתולוגיה

פרוסות של היפוקמפוס ממכרסמים משמשות לעיתים קרובות במחקר של תפקוד סינפטי ופלסטיות ביונקים. כאן אנו מציגים פרוטוקול להשגה ובחינה של פרוסות מחולדות ועכברים מבוגרים, להם גולגולות עבות יותר ורקמה חיבורית קשיחה יותר מאשר לחולדות ועכברים צעירים. מאפיינים אלו עלולים לעכב את הוצאת המוח או את הדיסקציה, ובעקבות זאת לבטל או להגזים הבדלי גיל ממשיים בתפקוד הסינפטי ובפלסטיות.

בנוסף, הזדקנות ופתולוגיה עמילואידית עשויות להחמיר את הנזק להיפוקמפוס שנגרם במהלך הליך הניתוח, ובכך לסבך עוד יותר את המסקנות המופקות מההערכה הפיזיולוגית. בהדגמה זו, אנו דנים בצעדים שננקטו במהלך הליכי השליפה והניתוח כדי למזער בעיות אלו. ראשית, המוח נשלף במהירות ומונח בנוזל חוט שדרה מלאכותי, קר, עם ריכוז נמוך של סידן, על קרח.

לאחר מכן מוציאים בעדינות את ה-hippo campi על משטח ניתוח קר במיוחד (על קרח), ומכינים פרוסאות היפוקמפוס באמצעות הוברטור (vibratome) ומדגירים אותן ב-A CSF מחומצן המכיל סידן. לבסוף, מעוררים פוטנציאלים וזרמים סינפטיים במספר תתי-אזורים של ההיפוקמפוס ומקליטים אותם; התוצאות שהתקבלו מדגימות את ההשפעות של הזדקנות ו/או פתולוגיה דמוית אלצהיימר על התפקוד והפלסטיות הסינפטית. שימוש נכון בטכניקה זו בעל השלכות על הבנת הירידה הקוגניטיבית הקשורה לגיל ודמנציה עקב מחלת אלצהיימר.

זאת מכיוון שתפקוד סינפטי לקוי הוא אחד הסממנים הביולוגיים המוקדמים ביותר לתסמינים קליניים אלו, כפי שמוסבר בפרוצדורה זו. היום נדגים זאת יחד עם ד"ר כריס נוריס, ראש המעבדה, לצד כיור גדול. הכינו את אזור הניתוח להוצאת המוח ולביצוע דיסקציה של ההיפוקמפוס.

הכלילו מגבת נייר מקופלת, להב סקלפל מספר 11, מספרי BB, מלקחי עצם וכלי היפוקמפוס, שפתונית כפולה מיוחדת מכלי כירורגיה עדינים. כמו כן, הניחו מספריים כירורגיים קטנים, שפתונית דקה, פיפטה פלסטית, נייר סינון Watman, צלחת פטרי זכוכית של 100 מילימטר מלאה בקרח, כף פלסטיק וכלי כימי עם תמיסת סידן נטולת סידן שהופשרה חלקית. CSF מכוסה ב-param.

לאחר עריפת ראשו של החולדה, יש להוציא את המוח במהירות האפשרית. הניחו את הראש על מגבת נייר, ובעזרת סקאלפל בצעו במהירות חתך במרכז הקרקפת, מעצם האף ועד לעצם העורפ.

יש לוודא שהחיתוך דרך השריר העורי הוא מלא, כך שתפרים של הגולגולת ייחשפו לחלוטין. אחזו את הראש בחוזקה וחתכו דרך הלוחיות העורפיות, הקודקודיות והמצחית לאורך תפר האמצע. יש להקפיד להצמיד את המספריים התחתונים בחוזקה לפני השטח הפנימיים של הגולגולת ולהרחיקו מהמוח.

דבר זה קריטי כדי למנוע חריצה לא מכוונת. לשקף הבא. החלקו את הלסנאות תחת הלוח הפריאטלי השמאלי ולחצו את הלסנאות זו אל זו, תוך גלגול כלפי מעלה וקדימה כדי להפריד את הלוחות הפריאטליים והאוקסיפיטליים.

במידת הצורך, השתמשו במלקחי Ron כדי להסיר גם את הלוחית הפרונטלית השמאלית. חזרו על הפעולה עבור ההמיספירה השנייה. לאחר שהלוחיות הוסרו, השתמשו במלקחי Ron או במספריים כדי למשוך בעדינות או לגזור כל חלק של הקרומי הקשיח (dura mater) שעשוי להיות צמוד ללוחיות הטמפורליות ומתוח על פני שטח המוח.

כעת החליקו את ה-Ron jurors בין המוח לבין הלוח הטמפורלי הימני, תוך הפעלת לחץ לעבר הגולגולת והרחקה מהמוח. לחצו וסובבו את הלוח הטמפורלי החוצה עד שיישמע או יורגש רעש של פקיעה. חזרו על הפעולה בצד שמאל.

החליקו את השפשול הרחב לפני כלי ההיפוקמפוס בין המשטח הוונטרלי של המוח לבין לוחיות הגולגולת התחתונות, עד שיהיה כולו מתחת למוח. הזיזו אותו לצדדים, קדימה ואחורה מספר פעמים כדי לנתק עצבים קרניאליים שלמים באמצעות כלי ההיפוקמפוס. הוציאו את המוח והטביעו אותו ב-A CSF נטול סידן, כסו ב-Parfum והניחו לו להתקרר למשך כדקה אחת.

כדי להוציא את ההיפוקמפוסים (hippo campi), השתמש בכף כדי להוציא את המוח מתוך ה-A CSF והנח אותו על נייר Watman שהורטב ב-CSF על מכסה של צלחת פטרי קרה במקפיא. בעזרת להב סכין מנתחים, הסר את המוחון וכשליש מהאונויות הפרונטליות הרוסטרליות. כעת, חתוך דרך החריץ הבין-המ hemispheric כדי להפריד לחלוטין בין שתי ההמיספרות.

החזירו המיספירה אחת אל תוך ה-A CSF slushie והעמידו את השנייה על משטח הניתוח כך שהמישור הקורונלי של האונה המצחית פונה כלפי מטה; גזע המוח והמוח האמצעי הלבנים צריכים להיות מובחנים בקלות מהקורטקס הוורוד או האפורי שמעליהם. אתרו את ה-calli במוח האמצעי. אלה ייראו כשני בליטות לבנות ויימצאו בחלקו העליון של המוח.

במיקום זה, החזקו בעדינות את המוח האמצעי במקומו באמצעות מספריים והחליקו את השפכטל בין הקליפה (cortex) לבין ה-calli. לאחר מכן, משכו בעדינות את גזע המוח, המוח האמצעי והתלמוס הרחק מהם. ייתכן שיהיה צורך לגזור רקמה מחברת או כלי דם בעזרת מספריים.

השתמשו בקצה החד של השפכיר (spatula) כדי לנתק את ה-fornix, צרור סיבים לבן הממוקם בחלק הדורסלי הקדמי של ההיפוקמפוס. בעזרת המספריים, המשיכו למשוך בעדינות את גזע המוח, המוח האמצעי והתלמוס הרחק מהשאר, מבלי לנתק אותם לחלוטין משאר המוח.

סיבי החומר הלבן היוצרים היפרבולה רדודה בתחתית ההיפוקמפוס צריכים להיות גלויים כעת בכיוון זה. באמצעות פיפטת העברה, התיזו בעדינות מעט A CSF לתוך הרווח שמתחת ל-FIA כדי לסייע בהפרדת ההיפוקמפוס מהקורטקס. החליקו בעדינות את השפכtold לתוך רווח זה, ובעודכם מחזיקים בחוזקה את גזע המוח, המוח האמצעי והתלמוס באמצעות המספריים, גלגלו את ההיפוקמפוס הרחק מהם. גזמו בעדינות שאריות של קורטקס, כלי דם וחומר לבן מההיפוקמפוס.

השקו עם מספר מיליליטרים של A CSF. בעזרת פיפטת העברה, שמרו על הרקמה רטובה וקרה באמצעות שלג CSF. לאחר מכן, הסירו את ההמיספære השנייה וחזרו על הדיסקציה כדי לחתוך את ה-hippo Campi של החולדה.

מלאו את מאגר הוויברטום ב-A CSF קר מאוד ונקי מסיד, כך שראש החיתוך והלהב יהיו טבולים לחלוטין. השתמשו בסכין מנתחים כדי לחתוך את הקצוות הרוסטרליים (הקדמיים) והקוודליים (האחוריים) של כל היפוקמפוס, והניחו אותם יחד על המשטחים הרוסטרליים כאשר ה-dentate gyrus של כל היפוקמפוס פונה כלפי השני. הדביקו את רקמת המוח לבלוק קיבוע והעבירו אותו לבמת החיתוך של הוויברטום.

עבור ניסויי פיזיולוגיה סינפטית, מומלץ להשתמש בחתכים בעובי 400 מיקרומטר. בעזרת פיפטת העברה בעלת פיה רחבה, העבירו את הפרוסות לצלח פטרי קטן המכיל נוזל CSF נטול סידן, קר במי קרח.

עם השלמת החיתוך, מעבירים את הפרוסות לתא השמירה, המולא ב-A CSF המכיל סידן ומחומצן. מעלים בהדרגה את טמפרטורת התא מ-27 מעלות ל-32 מעלות צלזיוס כדי לבצע הקלטות חוץ-תאיות בסיסיות. בפרוסות חדות, תא ההקלטה מסודר על במת המיקרוסקופ, כך ש-A CSF מחומם מראש מוזן באמצעות כוח המשיכה דרך ווסת זרימה ומסולק על ידי קו ואקום מרכזי.

בעזרת מכחול צבע קטן, העבירו פרוסה לתא ההקלטה כך שתהיה טבולה ב-A CSF ותנוחה על הרשת המותקנת. אפשרו לפרוסה להתרגל למשך 10 עד 15 דקות. בזמן שהפרוסה עוברת אקלמיזציה, הדליקו את הסטימולטור או את מבודד הגירויים והורידו את תפוקת המתח לאפס.

לאחר מכן, מקמו אלקטרודת גירוי מעל הפרוסה באזור ה-stratum radiatum של ca2, קרוב לגבול של ca3. הורידו את אלקטרודת ההקלטה אל ה-stratum radiatum של ca1, כך שרק תחדור מעט את פני השטח של הפרוסה. העלו את עוצמת הפלט של המגרה לרמה מתונה.

מבודד הגירוי מכוון לכ-150 microamps. הורד לאט את אלקטרודת הגירוי במרווחי זמן קצרים עד להקלטת ארטיפקט גירוי. ב-CA one, המשך להוריד לאט הן את אלקטרודת הגירוי והן את אלקטרודת ההקלטה במרווחי זמן, תוך רכישת תגובות CA one.

הקימו עקומת חוזק סינפטי עד שגלי הסיבים (fiber volley) ואמפליטודות הפוטנציאל הפוסטסינפטי העירורי יגיעו לרמות מקסימליות, תוך שימוש בתוכנת רכישת נתונים כגון clamp X. לאחר מכן, השתמשו בתוכנה כדי להגיש גירויים בטווח עוצמות שונה והקליטו את הפעילות התואמת ב-ca one. הטווח ומספר רמות עוצמת הגירוי שבהם תשתמשו צריכים להיות מספיקים כדי להפיק עקומה סיגמואידלית כאשר הם ממוצבים מול ערכי ה-FV או ה-EPSP.

כדי לבחון פלסטיקות סינפטית, כעת יש לאתחל את עוצמת הגירוי עבור כל פרוסה כך שתעורר תגובה של מיליוולט אחד. התחילו את גירוי הבסיס בתדר של 0.033 hertz EPSP. ערכי השיפוע צריכים להיות יציבים למשך 20 דקות לפחות לפני השראת פוטנציאציה ארוכת טווח LTP או דיפרסיה ארוכת טווח LTD.

כדי להקליט תקופת בסיס (baseline), השתמשו בקובץ פרמטרים של clamp X כדי להמריץ ולהקליט בכל 30 שניות. לאחר מכן, כדי להשרות LTP, פתחו קובץ פרמטרים נפרד והשרו LTP באמצעות רצף של שניות אחת של גירוי בתדר 100 hertz, או מספר פרצים קצרים של גירוי בתדר 200 hertz הניתנים בכל 200 milliseconds להשראת LTD. העבירו 900 פולסי גירוי בקצב של one hertz.

לאחר הגירויים, חזרו לקובץ הפרמטרים של קו הבסיס (baseline) ואספו תגובות סינפטיות למשך 60 דקות או יותר. השוו את ערכי השיפוע של ה-EPSP שהתקבלו לפני ו-60 דקות לאחר גירוי בתדר נמוך כדי לקבוע את נוכחותו של LTP, המזוהה עם עלייה בעוצמה הסינפטית, או LTD, המזוהה עם ירידה בעוצמה הסינפטית. מקובל להניח כי שני התהליכים משקפים מנגנונים קריטיים ללמידה ולזיכרון.

כאן מוצגות עקומות חוזק סינפטי מייצגות משני פרוסות היפוקמפוס שונות משני עכברי A PP PS.One. עכבר אחד טופל בריאגנט ויראלי חדש (adeno-associated viral) בעל השפעה נוגדת דלקת. העכבר השני טופל בריאגנט ויראלי של בקרה.

ניתן לראות זאת כאשר מספר דומה של סיבים פרה-סינפטיים מופעלים לאורך תנאי הטיפול השונים. כאשר קבוצות מראות אמפליטודות FV דומות כפי שמצוין בציר ה-x, עקומת הפרוסה שטופלה בריאגנט a מוסטה שמאלה, מה שמעיד על אמפליטודות EPSP גבוהות יותר. נתונים אלו מוכיחים כי החוזק הסינפטי הבסיסי גבוה יותר בפרוסה שטופלה בריאגנט a המוצגת כאן.

להלן התוצאות מניסויי LTP שבוצעו על אותן פרוסות. שימו לב כי ערכי השיפוע של ה-EPSP בפרוסת ריאגנט a גבוהים בהרבה ביחס לפרוסת הביקורת במהלך שעת בסיס אחת לאחר מתן גרייה של 100 הרץ, מה שמעיד על כך שה-LTP היה נוכח בפרוסת ריאגנט a אך לא בפרוסת הביקורת. איור זה מציג את מראה גלי ה-EPSP בפרוסות עכבר של ריאגנט A ושל ביקורת לפני ו-60 דקות לאחר מתן גרייה של 100 הרץ.

העלייה בשיפוע ה-EPSP בתקופה שלאחר ה-100 hertz בולטת מאוד בתוך פרוסה של reagent a, מה שמעיד על LTP משותף. הניסויים המופיעים בדמויות שהוצגו עד כה מצביעים על כך ש-reagent A מגביר את החוזק הסינפטי ומשפר גירעונות ב-LTP. ניסויים דומים בוצעו ב-PP PS one mice וב-LACS של היפוקמפוס מנשפני חולדות.

כאן מוצגות עקומות חוזק סינפטי משני פרוסות היפוקמפוס שונות מחולדה שטופלה בתרופה אנטי-דלקתית חדשה ומחולדה אחרת שטופלה בריאגנט בקרה (vehicle). שימו לב כי עקומות אלו דומות מאוד עבור שתי הפרוסות, מה שמעיד על כך שלתרופה A יש השפעה מועטה על החוזק הסינפטי הבזאלי. איור זה מציג תוצאות מניסויי LTD שבוצעו על אותן הפרוסות.

שימו לב כי בדומה לערכי שיפוע EPSP טיפוסיים בחולדות מזדקנות, בתוך פרוסה שטופלה בביקורת (vehicle) נרשמת ירידה בערכים במהלך קו הבסיס של השעה הראשונה שלאחר מתן גרייה של 1 Hz. עם זאת, ערכי שיפוע ה-EPSP בפרוסה שטופלה בתרופה A מראים ירידה מועטה עד אפסית, מה שמעיד על היעדר LTD. מוצגים כאן גלי ה-EPSP מפרוסות של חולדות שטופלו בתרופה A ובביקורת, לפני ו-60 דקות לאחר מתן גרייה של 1 Hz. הירידה בשיפוע ה-EPSP בתקופה שלאחר גריית ה-1 Hz בולטת מאוד בפרוסת הביקורת, אך לא בפרוסת תרופה A.

התוצאות בדמויות אלו מראות כי תרופה a משפרת הבדלי פלסטיות בחולדות מזדקנות על ידי חסימת השראת LTD, אך אינה משפיעה על התפקוד הסינפטי הבסיסי. נתונים אלו מראים כי ניתן לווסת פרמטרים מרובים של תפקוד סינפטי ופלסטיות בחולדות מזדקנות ובעכברי מודל לאלצהיימר באמצעות טיפולים ניסיוניים, ומדגישים את התועלת של פרוסות היפוקמפוס חדות לבחינת הפוטנציאל הנוטרופי ו/או הנוירופרוטקטיבי של תרופות וריאגנטים ניסיוניים חדשים. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור לאזן בין המהירות שבה מוציאים את המוח לבין הדיוק והעדינות בביצוע הדיסקציה, הפריסה והטיפול בהיפוקמפוס לצורך מדידות אלקטרופיזיולוגיות.