Name: הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-11T23:58:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: למד לייצר טרנסגנים ב-Caenorhabditis elegans באמצעות רקומבינרינג עם GalK כסמן בחירה. שיטה זו שומרת על רכיבי רגולציה מקוריים ומאפשרת שינויים גנטיים מדויקים במחקר פונקציונלי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות לינדסי נאש לקבלת עזרה בפיתוח הטכניקה. עבודה זו מומנה על ידי NIH כדי להעניק AG028977 אלף, פיילוט מענק מאוניברסיטת פיטסבורג OAIC (AG024827), וקרנות זרע מאוניברסיטת פיטסבורג.

<ol><li>Mello, C., Fire, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA transformation.</a> Methods Cell Biol. 48, 451-482 (1995).</li>
<li>Zhang, Y., Nash, L., Fisher, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simplified%2C+robust%2C+and+streamlined+procedure+for+the+production+of+C.+elegans+transgenes+via+recombineering%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A simplified, robust, and streamlined procedure for the production of C. elegans transgenes via recombineering.</a> BMC Dev Biol. 8, 119-119 (2008).</li>
<li>Antebi, A., Yeh, W. H., Tait, D., Hedgecock, E. M., Riddle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((daf-12+encodes+a+nuclear+receptor+that+regulates+the+dauer+diapause+and+developmental+age+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">daf-12 encodes a nuclear receptor that regulates the dauer diapause and developmental age in C. elegans.</a> Genes and Development. 14, 1512-1527 (2000).</li>
<li>Snow, M. I., Larsen, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+expression+of+daf-12%3A+a+nuclear+hormone+receptor+with+three+isoforms+that+are+involved+in+development+and+aging+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Structure and expression of daf-12: a nuclear hormone receptor with three isoforms that are involved in development and aging in Caenorhabditis elegans.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1494, 104-116 (2000).</li>
<li>Fisher, A. L., Page, K. E., Lithgow, G. J., Nash, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+K10C2.4+Gene+Encodes+a+Member+of+the+Fumarylacetoacetate+Hydrolase+Family.+A+CAENORHABDITIS+ELEGANS+MODEL+OF+TYPE+I+TYROSINEMIA%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol.Chem%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans K10C2.4 Gene Encodes a Member of the Fumarylacetoacetate Hydrolase Family. A CAENORHABDITIS ELEGANS MODEL OF TYPE I TYROSINEMIA.</a> J Biol.Chem. 283, 9127-9135 (2008).</li>
<li>Wightman, B., Ha, I., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Posttranscriptional+regulation+of+the+heterochronic+gene+lin-14+by+lin-4+mediates+temporal+pattern+formation+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Posttranscriptional regulation of the heterochronic gene lin-14 by lin-4 mediates temporal pattern formation in C. elegans.</a> Cell. 75, 855-862 (1993).</li>
<li>Lehrbach, N. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LIN-28+and+the+poly%28U%29+polymerase+PUP-2+regulate+let-7+microRNA+processing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">LIN-28 and the poly(U) polymerase PUP-2 regulate let-7 microRNA processing in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Struct Mol Biol. 16, 1016-1020 (2009).</li>
<li>Tursun, B., Cochella, L., Carrera, I., Hobert, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+robust+pipeline+for+the+generation+of+fosmid-based+reporter+genes+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A toolkit and robust pipeline for the generation of fosmid-based reporter genes in C. elegans.</a> PLoS One. 4, e4625-e4625 (2009).</li>
<li>Bamps, S., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+gene+expression+pattern+analysis%2C+in+situ%2C+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Brief.+Funct.+Genomic.+Proteomic%22%5BJournal%5D)">Large-scale gene expression pattern analysis, in situ, in Caenorhabditis elegans.</a> Brief. Funct. Genomic. Proteomic. , (2008).</li>
<li>Dolphin, C. T., Hope, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+reporter+fusion+genes+generated+by+seamless+modification+of+large+genomic+DNA+clones%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans reporter fusion genes generated by seamless modification of large genomic DNA clones.</a> Nucleic Acids Res. 34, e72-e72 (2006).</li>
<li>Sarov, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+recombineering+pipeline+for+functional+genomics+applied+to+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">A recombineering pipeline for functional genomics applied to Caenorhabditis elegans.</a> Nat. Methods. 3, 839-844 (2006).</li>
<li>Yang, X. W., Model, P., Heintz, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologous+recombination+based+modification+in+Escherichia+coli+and+germline+transmission+in+transgenic+mice+of+a+bacterial+artificial+chromosome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Homologous recombination based modification in Escherichia coli and germline transmission in transgenic mice of a bacterial artificial chromosome.</a> Nat Biotechnol. 15, 859-865 (1997).</li>
<li>Court, D. L., Sawitzke, J. A., Thomason, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+engineering+using+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Annu.Rev.Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic engineering using homologous recombination.</a> Annu.Rev.Genet. 36, 361-388 (2002).</li>
<li>Westenberg, M., Bamps, S., Soedling, H., Hope, I. A., Dolphin, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichia+coli+MW005%3A+lambda+Red-mediated+recombineering+and+copy-number+induction+of+oriV-equipped+constructs+in+a+single+host%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Escherichia coli MW005: lambda Red-mediated recombineering and copy-number induction of oriV-equipped constructs in a single host.</a> BMC Biotechnol. 10, 27-27 (2010).</li>
<li>Warming, S., Costantino, N., Court, D. L., Jenkins, N. A., Copeland, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+and+highly+efficient+BAC+recombineering+using+galK+selection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Simple and highly efficient BAC recombineering using galK selection.</a> Nucleic Acids Res. 33, e36-e36 (2005).</li>
<li>Penfold, R. J., Pemberton, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+suicide+vector+for+construction+of+chromosomal+insertion+mutations+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">An improved suicide vector for construction of chromosomal insertion mutations in bacteria.</a> Gene. 118, 145-146 (1992).</li>
<li>Praitis, V., Casey, E., Collar, D., Austin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+low-copy+integrated+transgenic+lines+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Creation of low-copy integrated transgenic lines in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 157, 1217-1226 (2001).</li>
<li>Puig, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+tandem+affinity+purification+%28TAP%29+method%3A+a+general+procedure+of+protein+complex+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The tandem affinity purification (TAP) method: a general procedure of protein complex purification.</a> Methods. 24, 218-229 (2001).</li>
<li>Rigaut, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+generic+protein+purification+method+for+protein+complex+characterization+and+proteome+exploration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A generic protein purification method for protein complex characterization and proteome exploration.</a> Nat.Biotechnol. 17, 1030-1032 (1999).</li>
<li>Achilleos, A., Wehman, A. M., Nance, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PAR-3+mediates+the+initial+clustering+and+apical+localization+of+junction+and+polarity+proteins+during+C.+elegans+intestinal+epithelial+cell+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">PAR-3 mediates the initial clustering and apical localization of junction and polarity proteins during C. elegans intestinal epithelial cell polarization.</a> Development. 137, 1833-1842 (2010).</li>
<li>Maduro, M., Pilgrim, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+cloning+of+unc-119%2C+a+gene+expressed+in+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Identification and cloning of unc-119, a gene expressed in the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Genetics. 141, 977-988 (1995).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

הדור של transgenes מ fosmids מציעה את היתרון של שמירה על כל מרכיבי מקדם הילידים, וריאנטים אחוי, ו 3 &#39;UTR אלמנטים רגולטוריים. זה יכול להוביל להקמת transgene שהוא מהורהר יותר של דפוס הביטוי הילידים, או בנייה של transgene פונקציונלי כאשר גישות אחרות להיכשל 5. Transgenes וכתוצאה מכך יכול לשאת מגוון של תגים epitope כולל GFP או תג TAP. בניית transgenes מעורבים שלושה שלבים אשר מבוצעים הכל ב SW106 15<...

<table><tbody><tr><td>ערכת FosmidMAX</td><td>Epicentre Biotechnologies</td><td>FMAX046</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq</td><td>Promega Corp.</td><td>M7122</td><td></td></tr><tr><td>מצע MOPS</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2120</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פוטסיום פוספאט 0.132 M</td><td>TEKnova, Inc.</td><td>M2102</td><td></td></tr><tr><td>D-galactose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>2-דאוקסיגלקטוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4407</td><td></td></tr><tr><td>ביוטין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4639</td><td></td></tr><tr><td>לוצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>NH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>F-530S</td><td></td></tr><tr><td>בסיס אגר מקונקי (MacConkey agar base)</td><td>BD Biosciences</td><td>281810</td><td></td></tr><tr><td>ערבינוז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3131</td><td></td></tr><tr><td>כלורמפניקול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונובסיס</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלוריד</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2025</td><td></td></tr><tr><td>בקטו-אגר (Bacto Agar)</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr></tbody></table>

הייצור של ג elegans transgenes דרך recombineering עם galk לבחירה מרקר

The Production of C. elegans Transgenes via Recombineering with the galK Selectable Marker

יצירה של חיות טרנסגניות הוא מנוצל באופן נרחב ב C. elegans המחקר כולל שימוש חלבונים GFP היתוך ללמוד את הרגולציה דפוס הביטוי של גנים של עניין או דור של טיהור זיקה טנדם (TAP) מתויג גרסאות של גנים ספציפיים על מנת להקל הטיהור שלהם. בדרך כלל transgenes נוצרות על ידי הנחת יחצן במעלה הזרם של גן ה-GFP הכתב או cDNA של עניין, ואת זה לעתים קרובות מייצר דפוס הביטוי נציג. אולם, אלמנטים קריטיים של ויסות הגנים, כגון אלמנטים לשלוט באזור מתורגמים של 3 או מקדמי חלופיים, יכול לפספס על ידי גישה זו. יתר על כן רק גרסה אחת אחוי ניתן ללמוד בדרך כלל על ידי אמצעי זה. לעומת זאת, השימוש של תולעת ה-DNA הגנומי נישא על ידי שיבוטים fosmid DNA סביר כוללת את רוב אם לא כל הגורמים המעורבים בוויסות גנים in vivo, אשר מאפשרת יכולת טובה יותר כדי ללכוד את דפוס הביטוי העיתוי אמיתי. כדי להקל על הדור של transgenes באמצעות DNA fosmid, אנו מתארים E. coli מבוסס הליך recombineering להכניס GFP, ברז, תג, או רצפי עניין אחרים לתוך מקום בגן. ההליך עושה שימוש הגן galK כסמן הבחירה הן הצעדים מבחר חיוביים ושליליים recombineering שתוצאתה השגת השינוי הרצוי עם יעילות גבוהה. יתר על כן, פלסמידים המכילים את הגן galK מוקף נשק הומולוגיה ל-GFP נפוצים TAP גנים היתוך זמינים אשר להפחית את העלות של oligos בשיעור של 50% בעת יצירת ה-GFP חלבון TAP או היתוך. פלסמידים אלה משתמשים מוצא שכפול R6K אשר מונע את הצורך לטיהור PCR נרחב של המוצר. לבסוף, אנו גם להפגין טכניקה לשלב את הסמן UNC-119 על לשדרת fosmid המאפשר fosmid להיות מוזרק ישירות לתוך תולעים או מופצצים כדי ליצור חיות טרנסגניות. וידאו זה מדגים את ההליכים הכרוכים יצירת transgene דרך recombineering באמצעות שיטה זו.

היכולת לייצר עבור transgenes<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; באמצעות הדנ&quot;א הגנומי נישא על ידי fosmids הוא אטרקטיבי במיוחד כמו כל האלמנטים הרגולציה יליד נשמרות. המתואר הוא הליך פשוט חזקים לייצור transgenes דרך recombineering עם<em&gt; GalK</em&gt; סמן לבחירה.

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

יצירת בעלי חיים טרנסגניים נמצאת בשימוש נרחב במחקרי *C. elegans*, כולל שימוש בחלבוני היתוך GFP כדי לחקור את הוויסות ו...

המטרה הכללית של הניסוי הבא היא להפיק טרנסגנים באמצעות DNA גנומי של תולעת הנשא בספריית השבטים SMID. השימוש ב-DNA גנומי משמר את כל אלמנטי הבקרה הטבעיים, כגון מחזקים (enhancers) באזורי ה-3' UTR. דבר זה מושג על ידי העברת ה-FO smid למאבקי E. coli מזן SW 1 0 6 כדי לנצל את מנגנון הרקומבינציה המושרה lambda red.בשלב שני, הגן GAL K מוחדר למיקום הרצוי ב-FO smid, המסמן את האתר שבו ימוקם ה-GFP או תג ה-tap. לאחר מכן, הגן Gade מוחלף על ידי GFP או tap TAC באמצעות רקומבינציה הומולוגית, ולאחריה ברירה שלילית באמצעות דאוקסי-גלקטוז על מנת ליצור את הגן המשונה. התוצאות מראות כי ניתן ליצור טרנסגנים אלה במהירות ובהצלחה, בהתבסס על אימות ההחדרה באמצעות colony PCR.שלום, שמי Love Ship. אני עובד במעבדה של Fisher באוניברסיטת פיטסבורג. היום אדגים את הטכניקה ליצירת טרנסגן של C elegant.מדוע לבצע רקומבינציה עם GK כסמן לבחירה. היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות ליצירת Cogan Transgenes הוא שבטכניקה זו אנו משתמשים ב-DNA הגנומי של הגן המבוקש, ובכך אנו מסוגלים לכסות את כל האלמנטים הקריטיים של ויסות הגנים, כגון אלמנטים בקרי באזור ה-three prime UTR, תמלילי שחבור חלופיים, מקדמים חלופיים ומגברים מרוחקים, שעלולים להישמט בגישות סטנדרטיות המבוססות על שיクלו닝 קונבנציונלי. אז בואו נתחיל.הזמינו את שיבט ה-FO smid עבור הגן המבוקש (GOI) משירות גנים, תוך שימוש ב-Worm Base כמדריך. בעת בחירת השיבטים, נבחר באלו שבהם ה-GOI נמצא במרכז הרצף. ייתכן ששיבטים שאינם כוללים גנים שכנים יהיו עדיפים, אך עשוי להיות קשה למצוא עבורם תרבית.את שיבט ה-SMID עבור ה-GOI ב-LB המכיל 12.5 micrograms per milliliter chloramphenicol, השבטים נשלחים בזן EPI 300 וניתן לגדלם ב-37 degrees Celsius. לאחר מכן, גדלו תרבית לילה של 1.5 milliliter של ה-SMID ב-37 degrees Celsius ובצעו mini prep ל-DNA של ה-smid. באמצעות ערכת Epicenter SMID prep, אנו פועלים לפי הפרוטוקול החלופי המתואר בהוראות, הכולל הוספה של תערובת Ribo shorter בשלב מוקדם יותר, קבעו את ריכוז ה-FOSS DNA.השימוש בספקטרופוטומטר מראה בדרך כלל ערך נמוך מאוד אך מספיק. לצורך ביצוע אלקטרופורציה מוצלחת, הכינו תאי SW 1 0 6 בעלי כשירות אלקטרומגנטית (electro competent) על ידי גידול של תרבית לילה של 5 mL במצע LB בטמפרטורה של 32 °C בתוך מבחנה עם מכסה מסוג snap cap בנפח של 14 mL.בבוקר למחרת. הפיקו מיליליטר אחד של התרבית לתוך 100 מיליליטר של lb בבקבוקon של שני ליטר. גדלו את חיידקי SW 1 0 6 עד ל-OD 600 של 0.6 עד 0.8.אין לבצע הלם חום. יש לשקיע את התאים על ידי סבב צנטריפוגה ב-5,000 Gs למשך חמש דקות. יש להשעות מחדש את המשקע על ידי ערבוב עדין במכשיר וורטקס (vortexing) במיליליטר אחד של 10% glycerol קר במי קרח.לאחר מכן, הוסיפו 50 milliliters של 10% glycerol קר מאוד. חזרו על שלב שטיפה זה פעם אחת. לבסוף, השקיפו את SW 1 0 6 שוב באמצעות צנטריפוגה והסִירו את כל הנוזל מלבד כ-500 microliters מכל עלון.שעלו את המשקעים באמצעות ערבול עדין במכשיר vortex, הקפיאו מנות של 100 µL בחנקן נוזלי או על קרח יבש ואחסנו בטמפרטורה של 80°C- עד למועד הטרנספורמציה. בצעו טרנספורמציה של ה-fos DNA לתאי SW106 אלקטרו-קומפטיים באמצעות אלקטרופורציה של החיידקים עם כ-50 ng של fos DNA בקוובטות בעלות מרווח של 0.1 cm, תוך שימוש במכשיר electroporator מדגם EOR 2510 במתח של 1,350 V. השCיבו את החיידקים ב-1 mL של LB למשך שעה אחת בטמפרטורה של 32°C, זרעו על מצעי LB עם כלורמפניקול (chloramphenicol) והדגירו בטמפרטורה של 32°C למשך הלילה.אששו את נוכחות הגן המבוקש באמצעות colony PCR על ידי גידול של תרבית לילה של חמישה מיליליטר ב-LB עם 12.5 micrograms per milliliter chloramphenicol בטמפרטורה של 32 °C. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 µL מהתרבית לתגובת PCR סטנדרטית עם האוליגו-נוקלאוטידים הפלנקיים (flanking oligos), והאריכו את דגירת ה-95 °C הראשונית לחמש דקות כדי ללייז את הבקטריות לפני התגובה. לבסוף, הכינו מלאי גליצרול (glycerol stock) לאחסון ארוך טווח, במטרה להחדיר את הגן gal K לתוך ה-FO smid הנושא את הגן המבוקש שלכם.ראשית, הכינו מצעי MOPS minimal media המכילים 0.2% galactose. ראו את החלק הכתוב של פרוטוקול זה עבור המתכון. לאחר מכן, בצעו הגברה באמצעות PCR עבור הקסטה P mod four gal, k, g או P mod four gal K GT.אנו משתמשים ב-fusion או ב-go tac gel. טהרו את תוצר ה-PCR שהתקבל. כמותו את היבול על ג'ל או באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop.אחסן את תוצר ה-PCR בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. זרע חמישה מיליליטר של מצע הכולל chloramphenicol עם תאי SW 1 0 6 המכילים את ה-Foss DNA, וגדל למשך לילה בטמפרטורה של 32 מעלות צלזיוס. הוסף מיליליטר אחד של תרבית הלילה ל-100 מיליליטר של lb ו-chloramphenicol. בתוך בקבוק של שני ליטר, גדל עד להגעה ל-OD של 0.6 עד 0.8.שלב זה נמשך בדרך כלל שלוש עד ארבע שעות בזמן שהתרבית גדלה. הגדירו אמבט מים נערנער ל-42 °C כדי לחמם בקראך סטרילית בנפח 250 milliliter המוצבת במחזיק. השימוש באמבט מים נערנער בשלב הבא הוא קריטי להשגת יעילות גבוהה.בשלב הבא העבירו 50 מיליליטר של תרבית SW 1 0 6 לבקבוק 250 מיליליטר ובצעו הלם חום בטמפרטורה של 42 °C ובמהירות של 100 RPM למשך 20 דקות בדיוק באמבט מים רועד. השאירו את שארית החיידקים בטמפרטורה של 32 °C כדי שישמשו כביקורת לא מושרה. קררו את החיידקים המושרים והבלתי מושרים על קרח למשך 10 דקות.העבירו את הדגימות לשני מבחנות צנטריפוגה סטריליות והשקיעו במהירות של כ-5,000 Gs למשך חמש דקות. שפכו את כל הנוזל העליון (supernatant) ותלו את המשקע በሚליליטר אחד של 10% glycerol קר בקרח באמצעות ערבול עדין (vortexing). הוסיפו 49 מיליליטרים נוספים של 10% glycerol קר בקרח.חזור על שטיפה זו ולאחר מכן צנטריפוג את התמיסה שוב להשקעת המשקע. הסר את העל-נוזל על ידי היפוך המבחנות ותלה את המשקע בכמות הקטנה של הנוזל שנותרה. חלק לדגימות של 100 microliter. הקפא על קרח יבש ואחסן בטמפרטורה של minus 80 degrees Celsius עד למחרת.בצעו אלקטרופורזה לתאים מושרים ולא מושרים של SW 1 0 6 עם 150 nanograms של תוצר ה-PCR שהוכן, תוך שימוש בקובטות עם מרווח של 0.1 centimeter באלקטרופורזה של einor 25 ton. הגדירו למתח של 1,350 volts. השקמו את החיידקים ב-one milliliter של LB בתוך מבחנה מסוג Falcon בנפח 14 milliliter.דגרו בטמפרטורה של 32 °C למשך ארבע וחצי שעות. לאחר הדגירה, שקעו את החיידקים ב-13,200 RPM למשך 15 שניות והסביגו אותם מחדש במצע M9. אנא עיינו בחלק הכתוב של פרוטוקול זה כדי למצוא את המתכון. חזרו על שלב שטיפה זה פעמיים.כדי להסיר שאריות של מצע עשיר, השקיעו את התאים פעם נוספת ולאחר מכן השאיבו אותם ב-1 mL של M9 לפני ביצוע דילול סדרתי על מצע MOPS. דגרו במצע מינימלי במשך 3 עד 5 ימים בטמפרטורה של 32 °C בתוך אינקובטור. היו סבלניים, שכן הפוזיטיביים האמיתיים גדלים לאט; קומו מושבה על אגר MacCon כדי לטהר את המושבה ולוודא שהיא פוזיטיבית ל-GLK.המושבות אמורות להפוך לוורוד בהיר. בחר מושבה בודדת והזרק אותה לתרבית לילה של 5 mL של lb פלוס chloramphenicol, והדגר בטמפרטורה של 32 °C. אשר את השחלת ה-gal caging במיקום הנכון באמצעות PCR תוך שימוש באוליגואים השוליים.יש לעיין בטבלה 1 בחלק הכתוב של פרוטוקול זה. עבור רצפי האוליגו, יש להוסיף 0.5 µL מהתרבית לתגובת PCR סטנדרטית, ולהאריך את הדגירה הראשונית ב-95 °C לחמש דקות כדי לליית את החיידקים. תוצר ה-PCR אמור להראות עלייה בגודל בשל נוכחות הגן GAL K.לבסוף, הכינו מלאי גליצרול לאחסון. הכינו צלחות מצע MOPS מינימלי המכילות 0.2% deoxy galactose (או DOG) ו-0.2% glycerol. ראו את החלק הכתוב של פרוטוקול זה עבור המתכון. PCR.הגבירו את מקטעי התגיות מ-PMO 4G FP PBS 1761 או PBS 1479 באמצעות אותם אוליגונוקלאוטידים ששימשו בסבב הראשון, או באמצעות אוליגונוקלאוטידים קצרים ספציפיים ל-GFP או ל-tap. אם אתם יוצרים מספר מבנים, מומלץ במיוחד להשתמש באוליגונוקלאוטידים הקצרים, שכן ניתן להשתמש באותו תוצר PCR עבור כל המבנים. טהרו את תוצר ה-PCR ומדדו את ריכוזו באמצעות ג'ל או ספקטרופוטומטר. הכינו תאי W 1 0 6 קומפטנטים, מושראים ובלתי מושרים, הנושאים את ה-SMID עם הגן Gale K כפי שתואר קודם לכן. אלקטרופורו את תאי SW 1 0 6 המושרים והבלתי מושרים עם כ-100 nanograms של תוצר ה-PCR, תוך שימוש ב-0.1 centimeter gap Q vets ב-EINOR 25 10 ator המכוון ל-1,350 volts.שחזר במיליליטר אחד של LV בתוך מבחנה עם מכסה מסוג snap cap בנפח 14 מיליליטר, והדגר במיקרו-שייקר בטמפרטורה של 32 °C למשך ארבע וחצי שעות. שטוף ודלל את התאים ב-M nine כפי שהודגם קודם לכן. זרע את החיידקים על MOPS, מצע מינימלי המכיל 0.2% DOG ו-0.2% Glycerol. הדגר את הפלטות בטמפרטורה של 32 °C למשך שלושה ימים כדי לאשר את נוכחות ההחדרה.השתמשו בארבע מושבות כדי להחדיר עבור תרביות לילה של 5 mL ב-LB עם 12.5 µg/mL Chloramphenicol; בצעו colony PCR כפי שתואר קודם לכן. אנו משתמשים הן באוליגואים ספציפיים קצרים ל-GFP והן באוליגואים פלאנקינג (flanking) כדי להוכיח את השבב הנכון ואת האתר הנכון.ה-GFP הוא באורך של כ-800 זוגות בסיסים. ה-TAP הוא באורך של כ-550 זוגות בסיסים וה-gal KT הוא באורך של 1.4 Kilobases. לבסוף, הכין מלאי גליצרין (glycerol stock) לאחסון לטווח ארוך.שינוי ה-FO smed באמצעות רקומבינציה מניב תוצאות עקביות, ובשלב הברירה השלילית נצפתים באופן שגרתי שיעורי הצלחה העולים על 90%. בנוסף, פרוטוקול זה אורך כשבועיים עד להשלמתו, דבר ההופך את הכנת התראנסגנים למהירה למדי; מוצגות 48 מושבות שזוהו בצלחות DOG ושימשו ל-PCR של מושבות באמצעות אוליגו-נוקליאוטידים של flag GFP, אשר הגבירו את מקטע ה-GFP בניסוי זה. 47 מתוך 48 המושבות תוקנו כהלכה ומושבה אחת לא שונתה כראוי; מוצגות 48 מושבות שזוהו בצלחות DOG ושימשו ל-PCR של מושבות באמצעות אוליגו-נוקליאוטידים של flag GFP, אשר הגבירו את מקטע ה-GFP בניסוי זה.46 מתוך 48 מושבות הן נכונות ושתי מושבות אינן מושגות בשינוי נכון. הנקודה החשובה ביותר שיש לזכור בעת ביצוע ניסוי זה היא שיש לגדל את חיידקי SW 1 0 6 בטמפרטורה של 32 Celsius ולא בטמפרטורות גבוהות יותר, כיוון שגידול בטמפרטורה גבוהה יותר יבחר מוטנטים עם מוטציות הפוגעות במנגנון ה-Lambda red. לכן, בהצלחה בניסוי שלכם.

the-production-c-elegans-transgenes-via-recombineering-with-galk

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

וידאו זה מדגים את הטכניקה של microinjection לתוך בלוטת המין של C. elegans כדי ליצור חיות טרנסגניות.

הדור של Stable טראנסגנטי C. elegans שימוש Microinjection

תולעים טראנסגנטי משמשים בדרך...

דור טראנסגנטי ג elegans על ידי שינוי Biolistic

אנו מתארים שיטה רגיש לזהות הרגולטורים postembryonic של ביטוי חלבונים לוקליזציה...

RNAi הקרנת לזהות פנוטיפים Postembryonic ב ג elegans</em

(גני גן או epistasis) מסכים שיטתיים, בקנה מידה גדול סינטטיים גנטיים אינטראקציה יכולים לשמש כדי לחקור יתירות ומסלול-הצטלבות גנטית. כאן, אנו מתארים טכנולוגית תפוקה גבוהה כמותית סינטתית גנטית מערך הקרנה, כינת eSGA שפתחנו להבהרת יחסי epistatic ולחקור רשתות אינטראקציה גנטיות...

מיפוי רשתות פונקציונליות חיידקיים ומסלולים ב<em&gt; חיידקי Escherichia</em&gt; באמצעות מערכים גנטיים סינטטיים

פרוטוקול זה מתאר הליך מהיר וצריכת חומר נמוך לשילוב של מערכים חוץ-כרומוזומליים טרנסגניים בגנום Caenorhabditis elegans באמצעות קרינה אולטרה סגולה (UV). יתר על כן, פרוטוקול זה מתאים במיוחד לקווים טרנסגניים המשדרים מערכים חוץ-כרומוזומליים בקצב גבוה.

פרוטוקול מהיר לשילוב מערכים חוץ-כרומוזומליים עם קצב העברה גבוה לגנום C. elegans

חלבונים בדרך כלל מכילים מספר תחומים שיכולים להפעיל פונקציות סלולריות שונות. ג'ין לדפוק-outs (KO) לא מחשיב מגוון תפקודי זו. כאן, אנו מדווחים חילופי קלטת בתיווך רקומבינציה (RMCE) גישת מבנה-תפקוד מבוסס בתאי גזע עוברי KO המאפשרת דיסקציה המולקולרי של תחומים או הגירסות פונקציונליים השונים של חלבון.

מחקרי מבנה-תפקוד תאי גזע עוברי עכבר שימוש recombinase בתיווך Exchange קסטה

כאן, אנו מציגים שיטה להנדס את הגנום של C. elegans שימוש CRISPR-Cas9 ribonucleoproteins ותבניות תיקון התלויים הומולוגיה.

מהירה עם צינור נתיישב עבור יצירת מוטציות נקודה גנומית ב- C. elegans באמצעות CRISPR/Cas9 Ribonucleoproteins

מתוארים כאן היא שיטה ממוקדת, מרפבלי גנים מחיקה בקלמידיה trachomatis באמצעות קלטת מallelic exchange מוטזיס מוטציות, flaem.

מרקרבלי ג'ין מחיקה על-ידי קסטה מAllelic Exchange מוטגנזה בקלמידיה

תהליך הזרקה מיקרו-CRISPR/Cas9 לתיוג פלואורסצנטי אנדוגני בקו הנבט Caenorhabditis elegans לקבלת קווי הדחיפה הומוזיגוטיים לניתוח מיקום חלבונים בחיים.

תיוג פלואורסצנטי אנדוגני בתיווך CRISPR/Cas9 של גנים ספציפיים לקו הנבט ב-Caenorhabditis elegans

יישום electrophysiology כדי סינפסות נגיש מספק מדד לכימות הפעילות הסינפטית, שימושי בניתוח מוטנטים הסינפטי. מאמר זה מתאר שיטה לנתיחה נהג לחשוף את בצמתים neuromuscular (NMJ)...

הביתור, הקלטה מ צומת C. elegans Neuromuscular

למד לייצר טרנסגנים ב-Caenorhabditis elegans באמצעות רקומבינרינג עם GalK כסמן בחירה. שיטה זו שומרת על רכיבי רגולציה מקוריים ומאפשרת שינויים גנטיים מדויקים במחקר פונקציונלי.

הייצור של ג elegans Transgenes דרך Recombineering עם GalK לבחירה מרקר

גלה סרטונים נוספים