בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין מורפולוגיה של זרע. זה מושג על ידי בידוד זכרים לדיסקציה יום אחד מראש. השלב השני של ההליך הוא ניתוח הזכרים כדי לשחרר זרע.

השלב השלישי של ההליך הוא הדמיה של מורפולוגיה של זרע. השלב האחרון של ההליך הוא הכנת זרע ליישומים במורד הזרם. בסופו של דבר, ניתן להשיג תוצאות המראות מורפולוגיה של זרע ויכולת הפעלה באמצעות טיפול במפעילי מבחנה.

פרוטוקול בידוד והפעלת הזרע פותח לראשונה לפני למעלה מ-30 שנה על ידי סם וורד, דיאן שייקס וגרגורי נלסון. כיום אנו משתמשים בהליך זה כדי לאפיין מוטציות המשנות את תפקוד הזרע והפוריות באלגנטיות C. המטרה הכוללת של הליך זה היא לדמיין CL elgan מורפולוגיה של זרע OID.

זה מושג על ידי בידוד זכרים יום אחד לפני הנתיחה על מנת לשמור עליהם רווקים. השלב השני כולל ניתוח הזכרים על מנת לשחרר זרעונים עגולים שאינם מודאליים. השלב השלישי הוא לדמיין את הפעלת הזרע במבחנה למורפולוגיה הבוגרת של זרע AME.

ההליך יודגם על ידי שלושה פוסט-דוקטורנטים במעבדה, ד"ר מאט מרצ'לו, ד"ר וצ'טרג'י וד"ר גונה SLU לבידוד זרע. ראשית, השג מספר רב של זכרים על ידי הכלאה של חמישה זכרים מסוג בר והרמפרודיטה אחת על מדשאה קטנה של אי קולי. חיידקי OP 50 יושבים במרכז מצע גידול נמטודה או צלחת NGM.

כ-50% מהדור הבא יהיו זכרים מסוג בר לאיסוף. זכרים בארבעה שלבים בוחנים את שלב ההתפתחות ומורפולוגיה של הזנב תחת מיקרוסקופ מנתח. תולעת L בעלת ארבעה שלבים נבחרת על סמך מורפולוגיה של הזנב.

לתולעת זכר יש זנב מעוגל ואילו להרמפרודיטה יש זנב מחודד. בעזרת חוט פלטינה, בחרו שבעה עד 10 זכרים בארבעה שלבים של ליטר בכל ניסוי והעבירו אותם לצלחת NGM עם זרע OP 50 ותנו להם לגדול במשך יום או יומיים. גידול זכרים רווקים בהיעדר הרמפרודיטים מונע אובדן זרע, ולכן מספר רב של זרעונים יהיה זמין במהלך הליך הניסוי.

לפני תחילת הדיסקציה, הכינו ליטר אחד של מאגר M תשע באמצעות שישה גרם נתרן מימן פוספט DI, שלושה גרם מונו אשלגן פוספט, חמישה גרם נתרן כלורי 0.25 גרם מגנזיום גופרתי, hep ללחות לליטר וחמישה מיליליטר מדיום זרע להפעלת זרע, מאגר M nine ואמצעי זרע מוכנים מתמיסות מלאי מעוקרות חיטוי או מסנן. ביום הנתיחה, העבירו את הזכרים הרווקים לצלחת NGM ללא חיידקים ותנו להם לזחול במשך כמה דקות. שלב זה מסייע בהסרת השכבה הקטנה של אי קולי המודבקת על פני התולעים.

לחלופין, פיפטה בנפח קטן של מאגר M 9 בזכוכית שעון והעבירו זכרים לתוך המאגר. לאחר מכן, בעזרת עט טפיחה, סמן א.עיגול קטן על צינור זכוכית באורך של 30 עד 50 מיקרוליטר של מדיום זרע אחד בתוך המעגל. המעגל ההידרופובי של עט הטפיחה עוזר לשמור על מדיום הזרע בתוך הגבול.

העבירו חמישה עד 10 זכרים למדיום הזרע באמצעות היקף ניתוח. החזק מזרק אחד או שניים בהתאם לרמת הנוחות. מחובר עם 27 מחטים בשתי הידיים, השתמש במחט אחת כדי להחזיק את התולעת והשתמש במחט השנייה כדי לחתוך את הקצה האחורי של הזכרים כדי לשחרר מוות בדם.

הזרעונים המשוחררים נראים כגרגירים זעירים תחת מיקרוסקופ הסטריאו. עם זאת, לפעמים חלק או רוב הזרעונים עשויים להישמר בתוך הפגר. במקרה כזה, גרירה עדינה של הפגר מעל מגלשת הזכוכית עשויה להקל על שחרור הזרעונים מהפגר.

כדי לדמיין את הפעלת הזרעונים, נתחו את התולעים במדיום זרע אחד המכיל פרונאז P E.תחת מיקרוסקופ מנתח, הניחו לתולעת לשבת במשך חמש דקות. לזרע מופעל יהיו פסאודופודים. הנח בעדינות פתק כיסוי על פני הדגימה המנותחת.

מצא את שדה הזרעונים מתחת להגדלה של פי 100. לזרעונים צורה עגולה. דוגמה לתמונת DIC של זרעונים מבודדים מאלגנטיות C זכרית מוצגת באיור 1.

הזרעונים הם כדוריים בצורתם והגרעינים בולטים. זרע מופעל במבחנה מוצג באיור 2, לזרעונים יש פסאודופוד בולט. 80 עד 95% מהזרעונים מומרים לזרעונים במידת הצורך.

השלב האחרון של ההליך יכול להיות הכנת זרע ליישומים במורד הזרם. לדוגמה, ניתן לקבע זרע לאימונופלואורסצנטיות. בסופו של דבר, התוצאות המתקבלות יכולות להראות את היכולת להפעיל זרע במבחנה ולבדוק מורפולוגיה של זרע.