Name: בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-31T19:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 46 s
Description: למדו לבודד ולהפעיל זרע מזכרי Caenorhabditis elegans במבחנה. השיטה כוללת ניתוח זכרים, טיפול בפרוטאז להפעלת ספרמטידים והדמיית מורפולוגיה במיקרוסקופיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים סמואל וורד, דיאן ג שייקים גרגורי נלסון עבור חלוצי הטכניקה הזו. אנו מודים Pavan Kadandale ובריאן Geldziler עבור קטעי וידאו המציג זרע מופעל, חברי המעבדה Singson לדיונים מועיל; CGC עבור זנים ו-NIH על תמיכתם בנו באמצעות מענק (R01HD054681).

1) העשרה של האוכלוסייה הגברית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהתאם לצורך הניסוי, מספר גדול של זכרים ניתן להשיג על ידי העסקת אחת האסטרטגיות הבאות: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אוכלוסייה גדולה של גברים סוג בר ניתן להשיג על ידי המעבר 5 זכרים סוג בר 1 אנדרוגינוס על הדשא קטן של OP50 seeded במרכז צלחת NGM. בערך 50% של בני הדור שלאחר יהיה סוג הזכרים בטבע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אותו-5 (e1490) או אותו-8 (e1489) הרמפרודיטים לזרוק מספר רב של גברים. אותו-5 ו-8 לו זכרים פוריים ואין פגם ברור במורפולוגיה הזרע ותפקודו. לכן, אותו-5-8 או אותו הזכרים יכולים לשמש במקום הזכרים סוג בר ניסויים רבים. </li></ol></li></ol> 2) זיהוי ובידוד של זכרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את המורפולוגיה הזנב של תולעים, תולעת הזנב של הזכר הוא מעוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק L4 הזכרים הבמה ולהעבירם seeded צלחת NGM עם E. coli OP50 ולתת להם לגדול במשך יום או יומיים. הזכרים מתנזר גידול בהעדר הרמפרודיטים למנוע אובדן של זרע ולכן מספר גדול של spermatids יהיה זמין במהלך הליך ניסיוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום לנתיחה, להעביר את הזכרים מתנזר על צלחת NGM ללא חיידקים ולתת להם לזחול בשביל כמה דקות. פעולה זו מסייעת להסיר שכבה קטנה של E. החיידק דבק על פני השטח של תולעים. לחלופין, נפח פיפטה קטנה של M9 חיץ (6 גרם Na 2 HPO 4, 3G KH 2 PO 4, 5 גרם NaCl, 0.25g MgSO 4 0.7 H 2 O לליטר) בכוס לצפות הזכרים להעביר לתוך המאגר. </li></ol> 3) Dissection של הזכרים והן הפעלה חוץ גופית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח שקופיות הזכוכית לסמן עיגול קטן באמצעות עט פאפ. פיפטה 30-50 μl של זרע בינוני 1X (HEPES 50mm, 25mm KCl, NaCl 45mm, 1mm MgSO 4, 5 מ"מ CaCl 2, 10mm דקסטרוז, pH 7.8) בתוך מעגל. המעגל הידרופובי עוזר לשמר את הזרע בינוני בתוך הגבול שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת הזכרים 50-10 על המדיום הזרע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הצגת שקופיות תחת מיקרוסקופ, להחזיק שני מזרקים מחוברים עם 27 מחטים מד על שתי הידיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באחת המחט "להחזיק" את התולעת ולהשתמש מחט אחרים לחתוך את הקצה האחורי של הזכרים לשחרר spermatids. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חיתוך התולעת בדרך כלל מגרש מספר עצום של spermatids מיידי. Spermatids נראים כמו דקה "גרגרי" תחת מיקרוסקופ הסטריאו. עם זאת, לפעמים חלק או רוב spermatids עשוי להישמר בתוך הפגר. במקרה כזה, בעדינות "גרירת" פגר על שקופיות הזכוכית עשויה להקל על שחרורו של spermatids מן השלד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפעיל את spermatids, לנתח את התולעים בינוני זרע המכיל E 1X Pronase (20μg/ml) ולתת להם לשבת במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אל תאפשר השקופיות להיות יבש בכל נקודת זמן הניסוי. הוסף בינוני זרע 1X יותר במידת הצורך. </li></ol> 4) ויזואליזציה של spermtids ו זרע <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות למקום coverslip על פני השטח של מדגם גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא את תחום spermatids בהגדלה נמוכה (10X) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרטים הקטנים של spermatids או זרע ניתן לראות על ידי מעבר ההגדלה גבוה יותר - בדרך כלל טבילה שמן 100x. </li></ol> 5) נציג תוצאות דוגמה תמונה של DIC spermatids מבודד זכר C. elegans מוצג באיור 1. Spermatids הם כדוריים בצורת גרעינים בולטים. הופעל בשנת זרע במבחנה מוצגות באיור 2. <img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig1.jpg" alt="איור 1"> באיור 1. DIC תמונה של ג elegans spermatids. <img src="/files/ftp_upload/2336/2336fig2.jpg" alt="איור 2"> איור 2. DIC תמונה של במבחנה מופעל C. elegans זרע.

<ol><li>Kimble, J., Crittenden, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controls+of+germline+stem+cells%2C+entry+into+meiosis%2C+and+the+Sperm%2FOocyte+decision+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Cell+and+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Controls of germline stem cells, entry into meiosis, and the Sperm/Oocyte decision in Caenorhabditis elegans.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 23, 405-433 (2007).</li>
<li>Lhernault, S. W., Roberts, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLhernault%2C+SW+%22Methods+in+Cell+Biology%22">Methods in Cell Biology</a>. , Vol. 48 273-301 (1995).</li>
<li>Hodgkin, J., Horvitz, H., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nondisjunction+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Nondisjunction Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 91, 67-94 (1979).</li>
<li>Altun, Z. F., Hall, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introduction+to+male+C.+elegans+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22WormAtlas%22%5BJournal%5D)">Introduction to male C. elegans anatomy.</a> WormAtlas. , ColdSpring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2008).</li>
<li>Shakes, D., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+spermiogenesis+in+C.+elegans%3A+a+pharmacological+and+genetic+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiation of spermiogenesis in C. elegans: a pharmacological and genetic analysis.</a> Dev Biol. 134, 189-200 (1989).</li>
<li>Nelson, G. A., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vesicle+fusion%2C+pseudopod+extension+and+amoeboid+motility+are+induced+in+nematode+spermatids+by+the+ionophore+monensin%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Vesicle fusion, pseudopod extension and amoeboid motility are induced in nematode spermatids by the ionophore monensin.</a> Cell. 19, 457-464 (1980).</li>
<li>L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+and+cell+biology+of+spermatogenesis+in+the+nematode+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">The genetics and cell biology of spermatogenesis in the nematode C. elegans.</a> Molecular and Cellular Endocrinology. 306, 59-65 (2009).</li>
<li>Chatterjee, I., Richmond, A., Putiri, E., Shakes, D., Singson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+spe-38+gene+encodes+a+novel+four-pass+integral+membrane+protein+required+for+sperm+function+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans spe-38 gene encodes a novel four-pass integral membrane protein required for sperm function at fertilization.</a> Development. 132, 2795-2808 (2005).</li>
<li>Xu, X., Sternberg, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+C.+elegans+sperm+TRP+protein+required+for+sperm-egg+interactions+during+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A C. elegans sperm TRP protein required for sperm-egg interactions during fertilization.</a> Cell. 114, 285-297 (2003).</li>
<li>Nelson, G., Roberts, T., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+spermatozoan+locomotion%3A+amoeboid+movement+with+almost+no+actin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans spermatozoan locomotion: amoeboid movement with almost no actin.</a> J Cell Biol. 92, 121-131 (1982).</li>
<li>Machaca, K., DeFelice, L. J., L'Hernault, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+chloride+channel+localizes+to+Caenorhabditis+elegans+spermatids+and+chloride+channel+blockers+induce+spermatid+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel chloride channel localizes to Caenorhabditis elegans spermatids and chloride channel blockers induce spermatid differentiation.</a> Dev Biol. 176, 1-16 (1996).</li>
<li>LaMunyon, C., Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+the+viability+of+mutant+and+manipulated+sperm+by+artificial+insemination+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Assessing the viability of mutant and manipulated sperm by artificial insemination of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 138, 689-692 (1994).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

בנוסף לניתוח מוטנטים SPE, פרוטוקול זה יש יישומים חשובים אחרים, כגון ניתוח מורפולוגיה הזרע עם ההזדקנות. Spermatids ו זרע בודד בפרוטוקול זה יכול לשמש בניסויים במורד אחרים כגון, immunostaining מסוג בר זרע מוטנטי 8, 9, תנועתיות הזרע על 10 שקופיות, מדידות פיזיולוגיות 9, 11, או אפילו הזרעה מלאכותית 12.

<table><tbody><tr><td>מזרק טוברקולין</td><td>BD Biosciences</td><td>309623</td><td>מזרק: 1 ml, מחט:&lt;br/&gt;27G X &amp;#189; in</td></tr><tr><td>עט Pap</td><td>Zymed Laboratories, Inc.</td><td>00-8888</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית למקרוסקופ VWR VistaVision HistoBond</td><td>VWR international</td><td>16004-406</td><td>מימדים:&lt;br/&gt;75X25X1mm</td></tr><tr><td>זכוכית כיסוי</td><td>VWR international</td><td>48366045</td><td></td></tr><tr><td>פרוטאז</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-6911</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד במבחנה הפעלת caenorhabditis elegans זרע

Isolation and In vitro Activation of Caenorhabditis elegans Sperm

זכרים הרמפרודיטים הם שתי צורות המינית נמצא באופן טבעי נמטודות C. elegans. זרע amoeboid מיוצרים על ידי שני גברים הרמפרודיטים. בשלב מוקדם יותר של gametogenesis, בתאי הנבט של הרמפרודיטים להתמיין מספר מוגבל של הזרע - בערך 300 - ו מאוחסנים &quot;תיק&quot; קטן שנקרא spermatheca. מאוחר יותר, הרמפרודיטים הרף לייצר ביציות 1. לעומת זאת, הזכרים מייצרים זרע רק לאורך הבגרות שלהם. הזכרים מייצרים זרע כל כך הרבה חשבונות עבור 50%&gt; של תאים הכולל 2 מבוגרים אופיינית תולעת. לכן, בידוד זרע מהזכרים קל יותר מזה של הרמפרודיטים. רק אחוז קטן של גברים נוצרות באופן טבעי, בשל הפער הלא ספונטני של כרומוזום X 3. מעבר הרמפרודיטים עם זכרים או בצורה נוחה יותר, את ההקדמה של מוטציות כדי להצמיח אותו (שכיחות גבוהה של זכרים) פנוטיפ כמה אסטרטגיות דרכו ניתן להעשיר את אוכלוסיית הגברים 3. זכרים ניתן להבחין בקלות על ידי התבוננות 4 מורפולוגיה הזנב הרמפרודיטים. הזנב של הרמפרודיט הוא הצביע, ואילו זנבו של הזכר הוא מעוגל עם מבנים ההזדווגות. חיתוך הזנב משחרר מספר עצום של spermatids מאוחסן בתוך מערכת הרבייה של הגבר. Dissection מבוצע תחת מיקרוסקופ סטריאופוני באמצעות מחטים מד 27. מאז spermatids אינם מחוברים פיזית עם כל שאר התאים, הלחץ ההידראולי מגרשת תוכן פנימי של הגוף הגברי, כולל spermatids 2. הזכרים גזור ישירות על ירידה קטנה של &quot;בינוני זרע&quot;. Spermatids רגישים שינוי ב-pH. לפיכך, HEPES, מתחם עם קיבולת חציצה טוב משמש בתקשורת הזרע. גלוקוז ומלחים אחרים מציגים בתקשורת זרע לסייע בשמירה על הלחץ האוסמוטי כדי לשמור על שלמות של הזרע. פוסט meiotic בידול של spermatids לתוך זרע נקרא spermiogenesis או הפעלה הזרע. מנענע 5, ונלסון 6 בעבר הראו כי spermatids עגול יכול להיגרם להתמיין זרע על ידי הוספת מרכיבים שונים, כולל הפעלת Pronase E. כאן אנו מדגימים במבחנה spermiogenesis של C. elegans spermatids באמצעות Pronase E. Spermiogenesis מוצלח הוא מראש הנדרשים לצורך פוריות ומכאן מוטנטים פגום spermiogenesis הם עקרים. מספר מוטציות עד כה הוכחו פגום במיוחד בתהליך spermiogenesis 7. חריגות שנמצאו במהלך בהפעלת במבחנה של הרומן SPE (spermatogenesis פגום) מוטנטים יעזור לנו לגלות שחקנים נוספים שהשתתפו באירוע.

פרוטוקול עבור בידוד והפעלת spermatids מן הזכר<em&gt; ג elegans</em&gt; מתוארת כאן. חיתוך הקצה האחורי של spermatids משחרר זכר. Spermatids יכול להיות מופעל על ידי תוספת של פרוטאז.

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

זכרים והרמאפרודיטים הם שתי הצורות המיניות המצויות באופן טבעי בנמטודה C. elegans. הזרע האמבואי מיוצר הן על ידי זכרים והן על ידי...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא ויזואליזציה של מורפולוגיית הזרע. דבר זה מושג תחילה על ידי בידוד הזכרים לצורך נתיחה יום אחד מראש. השלב השני של הפרוצדורה הוא נתיחת הזכרים לשחרור הזרע.השלב השלישי של הפרוצדורה הוא הדמיה של מורפולוגיית הזרע. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הכנת הזרע ליישומים עוקבים. בסופו של דבר, ניתן לקבל תוצאות המראות את מורפולוגיית הזרע ואת היכולת להפעלה באמצעות טיפול במפעילים in vitro.פרוטוקול בידוד והפעלת הזרע פותח לראשונה לפני למעלה מ-30 שנה על ידי Sam Ward, Diane Shakes ו-Gregory Nelson. כיום אנו משתמשים בהליך זה כדי לאפיין מוטציות המשנות את תפקוד הזרע והפוריות ב-C elegance. המטרה הכוללת של הליך זה היא להדגים את מורפולוגיית הזרע של CL elgan a OID.דבר זה מושג על ידי בידוד הזכרים יום אחד לפני הניתוח כדי לשמור אותם בצומות. השלב השני כולל ביצוע ניתוח לזכרים כדי לשחרר ספרמטידות עגולות שאינן מודאליות. השלב השלישי הוא הדמיה של הפעלת ספרמטידות in vitro עד למורפולוגיית זרע AME בוגרת.הפרוצדורה תודגם על ידי שלושה עמיתי פוסט-דוקטורט במעבדה, Dr.Matt Marchello, Dr and Chatterjee, ו-Dr.Guna SLU, לצורך בידוד הזרע. ראשית, השג מספר רב של זכרים על ידי הכלאה של חמישה זכרים מסוג בר (wild type) והרמפרודיט אחד על מדשאה קטנה של חיידקי e coli OP 50, שהוצבו במרכז של מצע גידול לנמטודות או פלטת

isolation-and-in-vitro-activation-of-caenorhabditis-elegans-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בידוד ערפדים של נוזלים מתאיים<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

נמטודות יכולות להתפשט בקלות במעבדה - בין השאר משום שההרמפרודיטים יכולים להתרבות על ידי הפריה עצמית. עם זאת, הצלבות גנטיות וניסויים אחרים עשויים לדרוש מספר רב של זכרים. סרטון זה מתאר שיטה להעשרה עבור זכרי C. elegans.

העשרה לזכרים: שמירה על מלאי של זכרי C. elegans

סרטון זה מציג שיטה לבידוד בלסטומרים של C. elegans מעוברים מוקדמים. התאים המתקבלים מתאימים לתרבית תאים או לניסויים ex vivo.

ג. אלגנס דיסקציה של בלסטומיר: שיטה להסרת קליפת הביצה ולניתוק תאים עובריים

אנו מתארים כאן פרוטוקול מתוקן לתרבות בקנה מידה גדולה של ג העוברי elegans תאים. עוברי ג elegans תאים בתרבית במבחנה באמצעות שיטה זו, מופיעים כדי לבדל ולשחזר את הביטוי של גנים באופן ספציפי בתא. טכניקות הדורשות גישה ישירה לתאים או בידוד של סוגי תאים ספציפיים מרקמות האחרות יכולות להיות מיושמות על ג elegans תאים בתרבית.

שיטה לCulturing עוברי<em&gt; ג elegans</em&gt; תאים

ביצה בתולעת assay (EIW) הוא שיטה יעילה לכמת-הטלת התנהגות. שינויים בנחת ביצה יכולים להיות תגובה התנהגותית של האורגניזם...

מדידת ההשפעות של חיידקים על<em&gt; ג Elegans</em&gt; התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה

זרע חייב לנווט בהצלחה דרך צינור ההטלה כדי להפרות oocyte. כאן אנו מתארים את הבקשה למדידת העברת זרע  בתוך הרחם הדו. הדבר יכול לספק נתונים כמותיים על חלוקת זרע בתוך הרחם לאחר ההזדווגות, כמו גם על מהירות, מהירות כיוונית ותדר היפוך.

מדידת הדרכה זרע ותנועתיות בתוך האלגיה של מערכת הרבייה של האנדרוגינוס

אלגנס נמטודה מתיחה גנטית Caenorhabditis יכול לשמש מודל פשוט וזול לגילוי תרופות. מתואר כאן פרוטוקול לזיהוי טיפולי נגדים המעכבים את האיתות במורד הזרם של חלבוני RAS ו- EGFR.

זיהוי מעכבי EGFR ו- RAS באמצעות אלגנים של Caenorhabditis

כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לבידוד תמצית גרעינית פעילה משלב זחל 4 C. elegans והדמיה של פעילות שעתוק במערכת במבחנה .

בידוד של תמצית גרעינית פעילה של Caenorhabditis elegans ו reconstitution עבור תמלול במבחנה

כאן, אנו מציגים שיטה כללית לקביעת הכדאיות העוברית והמספר הכולל של עוברים המיוצרים (brood) באמצעות אורגניזם המודל C. elegans.

מדידת כדאיות עוברית וגודל הברוד ב- Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה קובע שיטות לחילוץ וכימות תגובות לפרומון המין הנדיף ב- C. elegans, ומספק כלים לחקר תקשורת כימית ומסלול ניווט.

מיצוי פרומון מין נדיף ובדיקת כימותרפיה ב- Caenorhabditis elegans

כאן, אנו מציגים פרוטוקולים וכלים להמחשת סידן במהלך הפריה ועובריות מוקדמות באמצעות מדווח סידן מקודד גנטית המתבטא בקו הנבט של נמטודת המודל C. elegans.

הדמיה in vivo של מעברי סידן במהלך הפריה והתפתחות מוקדמת ב - C. elegans

למדו לבודד ולהפעיל זרע מזכרי Caenorhabditis elegans במבחנה. השיטה כוללת ניתוח זכרים, טיפול בפרוטאז להפעלת ספרמטידים והדמיית מורפולוגיה במיקרוסקופיה.

בידוד במבחנה הפעלת Caenorhabditis elegans זרע

גלה סרטונים נוספים