Name: Whole Cell-הקלטה של סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 29 s
Description: למדו כיצד להקליט זרמי סידן CRAC בתאי T אנושיים באמצעות טכניקת whole-cell patch clamp. שיטה זו מאפשרת מדידות אמינות של פעילות ערוצי סידן לחקר תפקוד תאי T ומחלות אוטואימוניות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנחנו אסירי תודה על המחלקה לפיזיולוגיה ממברנה לביולוגיה, אוניברסיטת קליפורניה דייויס לספק לנו מתקני אווירה מצוינת עבור המחקרים של תעלות יונים.

1. הכנת מנוחה לימפוציטים T האדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש RosetteSep קוקטייל האדם T Cell העשרה צפיפות בינונית RosetteSep, לטהר בתאי T דגימות דם אדם על פי הוראות היצרן. אוכלוסיית התאים וכתוצאה מכך אמור להכיל 95% CD3 + T תאים נחים. אנו לטהר לימפוציטים מסוג T האדם מן דגימות דם היקפיים שנאספו מתנדבים בריאים בהתאם לפרוטוקול שאושר על ידי מועצת UC Davis סקירה פנימית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר בידוד, resuspend בתאי T מנוחה בצפיפות של 0.5 x 10 6 תאים / מ"ל במדיום תרבית תאים המכיל RPMI-1640 בינוני עם גלוטמין ו HEPES, בתוספת 10% עגל בסרום עוברי, 2% GlutaMAX-I, 1% RPMI 1640 ויטמין פתרון, 1% RPMI 1640 פתרון חומצות אמינו, pyruvate נתרן 1%, ו 0.03% β-mercaptoethanol. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תא פלייס ההשעיה לתוך צלוחיות תרבית תאים ולשמור על 37 מעלות צלזיוס עם חממה humidified 5% CO 2 עד 24 שעות לפני הניסוי. </li></ol> 2. הכנה של לשכת הקלטה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הבאים יש צורך להכין את חדרי הקלטה: א) סיליקון O-טבעות, ב) עגולים, 25 מ"מ coverslips לנקות עם אתנול 70% ו מזוקקים H 2 O, ג) מעורבות Sylgard184, ערוכים לפי הוראות היצרן, ו ד) two 60 x 15 מ"מ צלחות פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום ~ 0.5 מ"ל של Sylgard184 מעורב לתוך צלחת פטרי 60x15 מ"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את חלקו התחתון של טבעת-O לתוך באמצעות מלקחיים Sylgard184. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר Sylgard184 עודף שפת טבעת-O על ידי הנחת טבעת O-על משטח נקי, כמו צלחת פטרי נוספת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הטבעת על coverslip ולחץ אותו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cure Sylgard184 ידי חימום לתאי על 85 מעלות צלזיוס במשך 40-60 דקות או עד Sylgard184 הוא polymerized. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות לתאי הקלטה במיכל אבק חופשי. </li></ol> 3. הכנת pipettes תיקון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביום הניסוי, למשוך pipettes בקוטר טיפ ~ 2 מיקרומטר באמצעות זכוכית נימים חולץ פיפטה. אנחנו משתמשים בצינור בורוסיליקט עם נימה (OD: 1.5 מ"מ מק"ט: 1.10 מ"מ). חנות pipettes במיקום אבק חופשי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל עם פיפטה טיפים Sylgard184 או HIPEC ציפוי מגן R6101 סמיקונדקטור, על פי נוהל קבוע 9. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות אש לצחצח את pipettes לפני הניסוי. </li></ol> 4. הצמד תיקון הגדרת הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר ולהציל את פקודות מאקרו ליצירת gigaseal בתוכנת שליטה תיקון מגבר-clamp שלך. אנו משתמשים מגבר EPC-10 נתמך על ידי Windows XP ו-Pulse תוכנה לרכישת הנתונים. הקמנו את "הגדרת", "על תאים", ו "כל תא" פקודות מאקרו על פי הוראות EPC-10 ו להשתמש בהם עבור כל הניסויים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו פתרונות אמבטיה פתרונות פיפטה המפורטים בטבלה 1 לפני הניסוי ולאחסן אותם על 4 מעלות צלזיוס עד 1 בשבוע. </li></ol><table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> כימיקלים </td><td colspan="3"> באת פתרונות (מ"מ) </td><td> פיפטה פתרונות (מ"מ) </td></tr><tr><td></td><td> # 1 </td><td> # 2 </td><td> # 3 </td><td></td></tr></tbody><tbody><tr><td> CH 3 SO 3 Na </td><td> 130 </td><td> 110 </td><td> 125 </td><td> - </td></tr><tr><td> NaCl </td><td> 2 </td><td> 4 </td><td> 5 </td><td> - </td></tr><tr><td> Ca (OH) 2 </td><td> - </td><td> 20 </td><td> - </td><td> - </td></tr><tr><td> MgCl 2 </td><td> 3 </td><td> 1 </td><td> - </td><td> 5 </td></tr><tr><td> MgSO 4 </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 2 </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 15 </td></tr><tr><td> HEDTA </td><td> - </td><td></td><td> 10 </td><td> - </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> - </td><td> - </td><td> 1 </td><td> - </td></tr><tr><td> Cs-spartate </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 125 </td></tr><tr><td> BAPTA </td><td> - </td><td> - </td><td> - </td><td> 12 </td></tr><tr><td> גלוקוז </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> 10 </td><td> - </td></tr></tbody></table> טבלה 1. פתרונות עבור כל תא הקלטות הנוכחית קרק. כל הכימיקלים נרכשו מ סיגמא אולדריץ, סנט לואיס, מיזורי. <ol start="3" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת פוטנציאל צומת הנוזלים (LJ) בין פתרון התיקון פיפטה וכל פתרון אמבטיה 10. שמור את הערך LJ במקום המתאים באמצעות תוכנת הרכישה שלך. לדוגמה, בתוכנית דופק להכניס את הערך LJ לתוך שליטה "LJ" בחלון "מגבר". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר ולהציל את הפרוטוקולים גירוי, כפי שמוצג באיור 1, במקום המתאים של התוכנה הרכישה שלך לפני הניסויים. בתוכנית Pulse, אנו קובעים את פרוטוקול רכישת בחלון "דור פולס". <img src="/files/ftp_upload/2346/2364fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. . פרוטוקול גירוי כבש מתח מ -120 ל 100 mV של 50 מילישניות משך מוחל על כל 0.2-2 s (5-0.5 הרץ). פוטנציאל אחזקות (V ח) בין רמפות נשמר mV 30. </li></ol> 5. תאים הרכבה על הבמה מיקרוסקופ <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעיל לתאי הקלטה עם פולי-L-ליזין עבור 20 דקות ולשטוף עם ~ H 2 O ואז עם תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS) לפני ציפוי התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500 פלייט μL ההשעיה התא המכיל 0.2-0.5 x10 6 תאים לתוך תא ו דגירה של 20 דקות בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את תא הקלטת עם תאים המחוברים בעל קאמרית. אנו משתמשים בעל מחוייט קאמרית, שבה תומכת בבסיס התחתון של coverslip, ואילו את החלק העליון בעדינות לוחץ על החלק העליון של coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום בעל קאמרית על הבמה של המיקרוסקופ הפוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס על התאים האור המועבר. אנו משתמשים אובייקטיבי 40X טבילה שמן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את אלקטרודת Ag / AgCl התייחסות לאמבטיה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את, multibarrel הכבידה מונחה מערכת זלוף. קצה הצינור יבוא צריך להיות ממוקם ב 45 מעלות זווית כדי לסגור את coverslip לשדה הראייה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקמו את צינור היניקה מול אל קצה צינור יבוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הקאמרית עם פוספט בופר סליין (PBS) או HBSS כדי לשטוף את תרבית תאים מדיה תאים מחוברים באופן רופף. </li></ol> 6. CRAC ערוץ הקלטה זרמים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מצא תא מחובר היטב coverslip. אנחנו בדרך כלל לבחור בגודל ממוצע, תא עגול עם משטח חלקה החיצוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse הקאמרית הקלטה עם Ca 2 + חינם, 3 מ"מ Mg 2 + אמבט המכילים פתרון # 1 (טבלה 1) ובה 0.5-1 מיקרומטר thapsigargin 8-10 דקות כדי לחסום את המשאבה SERCA. אנו מבצעים את הצעד הזה כדי לרוקן את החנות לפני היווצרות gigaseal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש microloader Eppendorf ו פיפטה-20-P תזוזה, למלא את פיפטה תיקון עם פתרון פיפטה (טבלה 1) להכניס את התיקון פיפטה לתוך מחזיק פיפטה על headstage את המגבר. Ca 2 + chelator BAPTA נכלל הפתרון פיפטה כדי פסיבי לרוקן את החנות כדי להפחית Ca 2 + תלויי איון ערוץ CRAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למרוח כמות קטנה של לחץ חיובי (~ 3 ס"מ של H 2 O) בתוך פיפטה את התיקון לפני הכניסה לאמבטיה. אנו משתמשים מחוייט ללחץ יניקה מכשיר המחובר אוויר דחוס קווי ואקום ליצור לחץ חיובי או שלילי בתוך פיפטה תיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיכים את פיפטה תיקון לאמבטיה תחת שליטה ויזואלית באמצעות מיקרוסקופ. בחלון "אוסצילוסקופ", אתה צריך לראות זרם זורם דרך פיפטה. שינוי צעד כמו משרעת הנוכחי צריך להיגרם על ידי דופק מתח קטן משרעת (מבחן הדופק) מיושם על ידי המאקרו מראש. בשלב זה, אתה אמור להיות מסוגל לקבוע את ערך ההתנגדות פיפטה. ההתנגדות של pipettes שלנו הוא בדרך כלל 5-6 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את "לקזז" הפוטנציאל שנוצר בין פיפטה לבין אלקטרודה השוואתית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת בקרה חזותית באמצעות המיקרוסקופ, מביא את קצה פיפטה קרוב לתא עד נוגע קרום התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל לחץ שלילי (20-40 ס"מ של H 2 O) בתוך פיפטה את התיקון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צג היווצרות gigaseal בחלון "אוסצילוסקופ". אתה תראה את המשרעת של הזרם, הנגרמת על ידי דופק את הבדיקה, מקטין את הערך של עליות פיפטה התנגדות&gt; 5 GΩ. צורות gigaseal בדרך כלל בתוך פהw שניות, אבל זה יכול לקחת 1-2 דקות כדי להשיג gigaseal יציב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצוי על קיבול פיפטה ("C-Fast"). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשבור את קרום תיקון על ידי הפעלת לחץ שלילי נוסף באמצעות מזרק 20 סמ"ק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הפוטנציאל להחזיק עד 30 mV. פוטנציאל חיובי מחזיק מסייעת במניעת סידן תלויי איון CRAC הערוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיצוי על קיבול הממברנה של התא ("C-איטי"); לשמור או להקליט את הערך של C-איטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את הערך של ההתנגדות גישה "R ים". בניסויים שלנו, של R הוא בדרך כלל 70-20 MΩ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל ליישם שורה של רמפות מתח עם תדר של 0.5 Hz (איור 1) של Ca 2 + ללא mM 3 Mg 2 + אמבט המכילים פתרון # 1. בפתרון זה, הנוכחי CRAC קטן negligibly בהשוואה עם "דליפה" הנוכחי עקב חדירות העניים של ערוצי CRAC עבור Mg 2 +. שמור את עקבות השימוש הנוכחי נרשם פתרון אמבטיה # 1 בניתוחים בעתיד כמו זרמים "דליפה". משרעת המוחלט של "דליפה" הנוכחי ב -100 mV צריך להיות פחות או שווה ל הרשות 5. אם התא הוא "דולף", להפסיק את הניסוי ולהתחיל מחדש בעזרת פיפטה תיקון חדש תא חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להקליט Ca 2 + הנוכחי דרך ערוצים CRAC (אני CA-CRAC), להחליף Ca 2 + 3 ללא Mg 2 מ"מ + אמבט המכילים פתרון # 1 עם 20 מ"מ Ca 2 + אמבט המכילים פתרון # 2 (טבלה 1) על ידי החלפת שסתומים זלוף. זה מאפשר Ca 2 + לזרום דרך ערוצים CRAC לייצר זרם פנימה. בחלון "אוסצילוסקופ", תוכל לראות התפתחות פנימית לתיקון אני CA-CRAC (איור 2). משרעת הזרם במתח שלילי ימשיך לעלות דקות על 1 בשל Ca 2 + תלויי potentiation של הנוכחי CRAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדלת התדירות של גירוי עם רמפות מתח 5 הרץ, אשר יש צורך להקליט את Na + חולף הנוכחית דרך ערוצים CRAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את 20 מ"מ Ca 2 + אמבט המכילים פתרון # 2 עם פתרון Na + המכילים קטיון ללא divalent # 3 (טבלה 1) על ידי החלפת שסתומים זלוף. בחלון "אוסצילוסקופ", תוכל לראות התפתחות חולף של משרעת גדולה יותר כלפי פנים לתיקון Na + הנוכחי באמצעות ערוצי CRAC (אני Na-CRAC; איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר להחיל 20 מ"מ Ca 2 + אמבט המכילים פתרון # 2 המכיל 1-5 מיקרומטר לה 3 + בסוף הניסוי כדי להקליט את "דליפה" הנוכחי. עם זאת, לא מצאנו גישה זו שימושית כי "דליפה" שינויים הנוכחי לאורך זמן זה עלול להיות גדול או קטן יותר בסוף הניסוי. אנחנו מעדיפים לקחת הנוכחית נרשמה Ca 2 + ללא mM 3 Mg 2 + אמבט המכילים פתרון # 1 בתחילת הניסוי בתור "דליפה" הנוכחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את עקבות הנוכחי נרשם לניתוח נוסף. </li></ol> 7. ניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחזר את הרשומות הנוכחי נשמר לתוך תוכנת ניתוח. אנו משתמשים בתוכנית דופק לניתוח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד את אמפליטודות הנוכחי בתחילת בסוף רמפות מתח. אנחנו בדרך כלל למדוד את אמפליטודות הנוכחית ב -100 mV ובבית באמצעות mV 100 זוגות של סמנים בחלון "אוסצילוסקופ" של התוכנית דופק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייצוא ערכי אמפליטודות הנוכחית לתוכנית גרפי לניתוח נוסף והצגה גרפית. אנו משתמשים Graphing מקור מדעי תוכנות ניתוח, גרסה 7. </li></ol> 8. נציג תוצאות <img src="/files/ftp_upload/2346/2346fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. CRAC זרמים תא T מנוחה אדם. (א), וכמובן זמן של זרמים CRAC נרשם תצורה מתח-clamp כל תא ב -100 mV (עיגולים מלאים) ו - 100 mV (עיגולים פתוח). לפני היווצרות gigaseal, התא היה preincubated דקות 10 ~ ב Ca 2 + ללא mM 3 Mg 2 + אמבט המכילים פתרון # 1 המכיל thapsigargin 0.5 מיקרומטר. לאחר פריצה, פתרונות אמבטיה יושמו ברצף כדלקמן: Ca 2 + ללא 3 מ"מ Mg 2 + אמבט המכילים פתרון # 1 (0 Ca + 3 מ"ג), ואחריו 20 מ"מ Ca 2 + אמבט המכילים פתרון # 2 (20 Ca), ואחריו פתרון divalent קטיון ללא אמבטיה # 3 (DVF), ואחריו פתרון אמבטיה # 2 (20 Ca). התא היה מגורה עם סדרה של רמפות מתח כפי שמוצג באיור 1. תדירות רמפות היה 5 הרץ בפתרון אמבטיה # 3 (DVF) ו 0.5 הרץ בכל פתרונות אחרים. הערה התפתחות איטית של אני CA-CRAC לאחר היישום של 20 מ"מ Ca 2 + אמבט המכילים פתרון # 2 ופיתוח חולף במהירות של אני Na-CRAC בפתרון אמבטיה DVF # 3. (ב), עקבות הנוכחית נציג שנרשמו במהלך רמפות מתח Ca 2 + ללא 3 מ"מ Mg 2 + אמבט המכילים פתרון # 1 ("דליפה"), 20 מ"מ Ca 2 + אמבט המכילים פתרון # 2 (20 Ca), והפתרון אמבטיה # 3 (DVF). (C, D), שוטפים מתח של יחסים אני CA-CRAC (ג) ואני Na-CRAC (ד ') מתקבל על ידי הפחתה של "דליפה" הנוכחי מן הזרמים שנרשמו במהלך-רמפות מתח 20 מ"מ Ca 2 + המכילים אמבטיה פתרון # 2 (20 Ca), והפתרון אמבטיה # 3 (DVF) המוצג בלוח (B).

<ol><li>Parekh, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Store-operated+CRAC+channels%3A+function+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Store-operated CRAC channels: function in health and disease.</a> Nat Rev Drug Discov. 9, 399-410 (2010).</li>
<li>Feske, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRAC+channelopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">CRAC channelopathies.</a> Pflugers Arch. , (2010).</li>
<li>Lewis, R. S., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitogen-induced+oscillations+of+cytosolic+Ca2%2B+and+transmembrane+Ca2%2B+current+in+human+leukemic+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Regul%22%5BJournal%5D)">Mitogen-induced oscillations of cytosolic Ca2+ and transmembrane Ca2+ current in human leukemic T cells.</a> Cell Regul. 1, 99-112 (1989).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current+%28ICRAC%29+due+to+local+calcium+feedback%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Rapid inactivation of depletion-activated calcium current (ICRAC) due to local calcium feedback.</a> J Gen Physiol. 105, 209-226 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Slow+calcium-dependent+inactivation+of+depletion-activated+calcium+current.+Store-dependent+and+-independent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Slow calcium-dependent inactivation of depletion-activated calcium current. Store-dependent and -independent mechanisms.</a> J Biol Chem. 270, 14445-1451 (1995).</li>
<li>Zweifach, A., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-dependent+potentiation+of+store-operated+calcium+channels+in+T+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Calcium-dependent potentiation of store-operated calcium channels in T lymphocytes.</a> J Gen Physiol. 107, 597-610 (1996).</li>
<li>Prakriya, M., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separation+and+characterization+of+currents+through+store-operated+CRAC+channels+and+Mg2%2B-inhibited+cation+%28MIC%29+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Physiol%22%5BJournal%5D)">Separation and characterization of currents through store-operated CRAC channels and Mg2+-inhibited cation (MIC) channels.</a> J Gen Physiol. 119, 487-507 (2002).</li>
<li>Fomina, A. F., Fanger, C. M., Kozak, J. A., Cahalan, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+channel+properties+and+regulated+expression+of+Ca%282%2B%29+release-activated+Ca%282%2B%29+%28CRAC%29+channels+in+human+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Single channel properties and regulated expression of Ca(2+) release-activated Ca(2+) (CRAC) channels in human T cells.</a> J Cell Biol. 150, 1435-1444 (2000).</li>
<li>Sakmann, B., Neher, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSakmann%2C+B+%22Single-Channel+Recording%22">Single-Channel Recording</a>. , 2nd edition, Plenum Press. New York. (1995).</li>
<li>Neher, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Correction+for+liquid+junction+potentials+in+patch+clamp+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Correction for liquid junction potentials in patch clamp experiments.</a> Methods Enzymol. 207, 123-1231 (1992).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

החקירה של זרמים אלקטרו CRAC ב נחים אדם בתאי T היא משימה מאתגרת כי משרעת אנדוגני הנוכחית CRAC בתאים אלה הוא קטן בשל גודל תאים קטנים (בקוטר מנוחה האדם T התא בטווח של 5-8 מיקרומטר). כאן, אנו מציגים הליך צעד אחר צעד באופן מהימן שיא זרמים CRAC בבני אדם לימפוציטים T מנוחה מבודדים תאים דם היקפיים mononuclear. טכנולוגיה זו מאפשרת לנו לחקור את הפיזיולוגיה ביטוי פונקציונלית של ערוצי CRAC בתאי T מנוחה כדי להבין טוב יותר את מהות נורמליים ופתולוגיים התגובות תא החיסון. באמצעות פרוטוקול זה, ניתן...

<table><tbody><tr><td>ערכה להעשרת תאי T אנושיים RosetteSep Human T Cell Enrichment Cocktail</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15061</td><td></td></tr><tr><td>תווך צפיפות RosetteSep Density Medium</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>15705</td><td></td></tr><tr><td>תווך RPMI-in 1640 עם glutamine/HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025501</td><td></td></tr><tr><td>סרום מעגל עגל (Fetal Calf Serum)</td><td>Omega Scientific</td><td>FB-01</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (תמיסה 100X)</td><td>Invitrogen</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ויטמינים RPMI 1640 (100X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7256</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חומצות אמינו 1640 (50X)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7131</td><td></td></tr><tr><td>סודיום פירובאט (Sodium pyruvate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>&amp;#946;-מרקפטו&amp;#8211;אתנול</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7522</td><td></td></tr><tr><td>אינוזיטול טריספוספט (Inositol trisphosphate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>19766</td><td></td></tr><tr><td>BAPTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4926</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine Hydrobromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2636</td><td></td></tr><tr><td>לנתנום כלוריד (Lanthanum Chloride)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>262072</td><td></td></tr><tr><td>תפסיגארגין (Thapsigargin)</td><td>Calbiochem</td><td>586005</td><td></td></tr><tr><td>ערכת אלסטומר סיליקון Sylgard 184 Silicon Elastomer Kit</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td></td></tr><tr><td>ציפוי הגנה למוליכים למחצה HIPEC R6101 Semiconductor Protective Coating</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שולחן מעבדה לבידוד רעידות בביצועים גבוהים מסדרת 63-500</td><td>Technical Manufacturing Corp.</td><td>63-540</td><td></td></tr><tr><td>מגבר patch clamp מדגם EPC 10 עם headstage</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטור</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך Olympus 1X71 עם עדשת שמן 40x</td><td>Olympus Corporation</td><td>1X71</td><td></td></tr><tr><td>מחשב Windows</td><td>Dell</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Pulse</td><td>HEKA Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת Origin לניתוח וגרף מדעי</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למשיכת פיפטות Patch</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>זכוכית בורוסיליקאט עם פילמנט (קוטר חיצוני: 1.5mm וקוטר פנימי: 1.10mm)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>BF150-110-7.5</td><td></td></tr><tr><td>Microforge של Narashige&amp;rsquo;s</td><td>Tritech Research, Inc.</td><td>MF-830</td><td></td></tr><tr><td>טבעות O-ring מסיליקון</td><td>McMaster-Carr</td><td>111 S70</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית (Coverslips) בגודל 25 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-102 25 mm 25CIR.-1</td><td></td></tr></tbody></table>

whole cell-הקלטה של ​​סידן סידן שחרור פעילה (crac) זרמים האדם לימפוציטים-t

Whole-Cell Recording of Calcium Release-Activated Calcium (CRAC) Currents in Human T Lymphocytes

ב לימפוציטים מסוג T, דלדול של Ca 2 + מ תאיים Ca 2 + חנות מוביל ההפעלה של plasmalemmal Ca 2 ערוצים +, שנקרא שחרור המופעל סידן סידן (CRAC) ערוצים. ערוצי CRAC לשחק תפקיד חשוב בוויסות של התפשטות תאים T ו ביטוי גנים. חריגה פונקציה CRAC ערוץ בתאי T נקשר חמורה כשל חיסוני ומחלות אוטואימוניות וכן בשילוב 1, 2. לימוד פונקציה ערוץ CRAC בבני אדם בתאי T עשויה לחשוף המנגנונים המולקולריים חדש המסדיר התגובות החיסוניות נורמלי לפענח את הגורמים מחלות אנושיות בנושא. הקלטות של זרמים אלקטרו קרום לספק הערכה מדויקת ביותר של נכסים ערוץ פונקציונלי ורגולציה שלהם. הערכה של זרמים אלקטרו CRAC ערוץ Jurkat בתאי T, לוקמיה האדם T שורת תאים, בוצעה לראשונה יותר מאשר לפני 20 שנה 3, לעומת זאת, מדידות CRAC הנוכחי נורמלי בתאי T אנושיים נותר משימה מאתגרת. הקשיים ברישום זרמי CRAC ערוץ נורמלי בתאי T הן מורכב על ידי העובדה דם הנגזרות לימפוציטים מסוג T הם הרבה יותר קטנים בגודל מאשר תאים Jurkat T, ולכן אנדוגני כל תא זרמים CRAC נמוכים מאוד משרעת. הנה, אנחנו נותנים הליך צעד אחר צעד שאנחנו משתמשים באופן שגרתי להקליט את Ca 2 + או Na + זרמים דרך ערוצים CRAC ב נחים אדם בתאי T מבודדים מהדם ההיקפי של מתנדבים בריאים. השיטה המתוארת כאן אומצה מהנהלים המשמש הקלטה הזרמים CRAC בתאי T Jurkat והופעל אדם בתאי T 4-8.

אנו מספקים פרוטוקול צעד אחר צעד עבור הקלטת כל תא תיקון מהדק של סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים היקפי mononuclear תאים שמקורם בדם אנושי לימפוציטים-T.

Whole Cell-הקלטה של ​​סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T

בתאי T, דלדול ה-Ca2+ מהמאגר הבלתי-תאי של Ca2+ מוביל להפעלה של תעלות Ca2+ פלסמאלמאליות, הנקראות תעלות Ca2+ המופעלות על ידי שחרור סידן...

תעלות סידן המופעלות על ידי שחרור סידן (Calcium release activated calcium channels) או תעלות CRAC, הממוקמות בממברנה הפלזמית, ממלאות תפקיד חשוב בשגשוג תאי T ובגירוי ביטוי גנים. גירוי של קולטני תאי T באמצעות אנטיגן מוביל להיווצרות השליח השני, inositol triphosphate, ולהפעלת שחרור סידן מהמאגרים באמצעות קולטני inositol triphosphate. ירידה בריכוז הסידן בתוך המאגר מובילה להפעלת תעלות CRAC ולעלייה עוקבת בריכוז הסידן בציטוזול. ליקויים בתפקוד תעלות CRAC בתאי T מקושרים למספר מחלות אנוש, כולל הפרעות של תסמונת חסר חיסוני משולב חמור (SCID) ומחלות אוטואימוניות.כאן מוצגת שיטה המאפשרת הקלטה אמינה וניתנת לשחזור של זרמי תעלות crack אנדוגניות של סידן ונתרן מתאי T אנושיים. ראשית, מיושם FSA garin, חוסם של Sarco endoplasmic reticulum Calcium ATPase, בתמיסה חוץ-תאית נטולת סידן או תמיסה המכילה 3mM מגנזיום כדי לרוקן את המאגר.הליך זה פותח תעלות סדק (crack channels) אך אינו גורם לזרם סדק בשל החדירות הנמוכה של תעלות הסדק למגנזיום. לאחר מכן, מבוצע קיבוע מתח של תא שלם (whole cell voltage clamp) על ממברנה של תא T. התא נשטף באמצעות תמיסת פיפט המכילה ריכוז גבוה של קלטור הסידן pta.לאחר מכן מיושמים ברצף תמיסות חוץ-תאיות המכילות סידן או תמיסות נטולות קטיונים דו-ערכיים, כדי להפעיל זרמי סידן ונתרן מדידים דרך תעלות CRAC.

whole-cell-recording-calcium-release-activated-calcium-crac-currents

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

המידור של חלבונים גם בתוך קרום פלזמה או אל מקומות תאיים הוא אחד מנגנון רגולטורי כי יכול מאוד להשפיע על התוצאות איתות, ולכן, כדי להבין איתות חשוב ללמוד את התנהגות במרחב ובזמן של חלבונים המעורבים. המתואר כאן מערכת מבוססת מיקרוסקופיה TIRF ללמוד התמרה האות בתאי T, אבל הוא החלים רחב.

טכניקה מיקרוסקופית TIRF הדמיה בזמן אמת סימולטני של TCR וחלבונים הקשורים אליו לשידור אותות

סרטון זה מנתח זרימת סידן הנגרמת על ידי קולטן תאי T בתאי T. נוגדנים נגד CD3 מפעילים את מסלולי האיתות של תאי T, מה שמוביל לעלייה ביוני סידן תוך תאיים הנקשרים לצבע Indo-1. בציטומטריית זרימה, מעבר ספקטרום ממצב נטול סידן למצב הקשור לסידן מתואם עם זרם סידן המושרה על ידי קולטן תאי T.

הערכת זרימת סידן הנגרמת על ידי קולטן תאי T באמצעות צבע מחוון סידן

אנו מתארים את בידודו של myocytes פרוזדורי אדם אשר יכול לשמש לתאיים...

בידוד של myocytes פרוזדורי אדם למדידות בו זמנית של Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ארעי וזרמים הממברנה

מתוארים נהלים לביצוע הקלטות בו זמנית של פוטנציאל הממברנה או זרם ושינויים בריכוז הסידן התוך תאי. נוירוני גרעין סופרכיאזמטיים ממולאים במחוון הסידן ביס-פורה-2 באמצעות אלקטרודת מהדק טלאי בכל תצורת מהדק התיקון של התא.

אלקטרו הקלטה בו זמנית ובסידן הדמיה של suprachiasmatic גרעין נוירונים

הקלטת זרמי Ca2+ בקרום הפנים של השחרור הפרה-סינפטי היא המפתח להבנה מדויקת של כניסת Ca2+ ושחרור נוירוטרנסמיטרים. אנו מציגים דיסוציאציה חריפה של חוט השדרה הצמד המניב אקסונים רשתית מבודדים פונקציונליים, המאפשרים הקלטה ישירות מקרום הפנים המשוחרר של מסופים פרה-סינפטיים בודדים.

החריפה דיסוציאציה של האקסונים Reticulospinal צמד ים כדי לאפשר הקלטה משחרור הפנים ממברנה של מסופי Presynaptic פונקציונליים פרט

כאן אנו מציגים טכניקות להדמיית אירועי Ca2+ מקומיים בתיווך IP3 באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתאי יונקים שלמים הטעונים באינדיקטורים Ca2+ יחד עם אלגוריתם שהופך את הזיהוי והניתוח של אירועים אלה לאוטומטיים.

ההדמיה המקומית Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; אותות בתאי יונקים בתרבית

מודלים עכבריים מאפשרים ללמוד מנגנוני מפתח של arrhythmogenesis. לשם כך, קרדיומיוציטים באיכות גבוהה נחוצים לביצוע מדידות מהדק תיקון. כאן מתוארת שיטה לבידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדרי מורין באמצעות זילוח לנגנדורף מבוסס אנזים מדרדר, המאפשר מדידות בו זמנית של סידן חולף וזרם סידן מסוג L.

בידוד מיוציטים פרוזדוריים וחדריים באיכות גבוהה למדידות בו זמנית של Ca2+ Transients וזרם סידן מסוג L

כאן שיטות המשמשות כדי ללמוד את ההשפעה התפקודית של מוטציות RYR1 בא לידי ביטוי אנדוגני וירוס אפשטיין בר מונצח B-לימפוציטים, ביופסיה שריר נגזר תאי לווין המובחנים myotubes מתוארים.

אפיון פונקציונלי של גרסאות RYR1 אנושיות מבוטאות אנדוגניות

זרם סידן, מדד לאיתות תאי T, הוא דרך יעילה לנתח תגובות לגירוי קולטן תאי T. פרוטוקול זה לריבוב Indo-1 עם לוחות נוגדנים המכוונים למולקולות פני התא מנצל את היכולות הגמישות ביותר של ציטומטריית זרימה בספקטרום מלא.

ניתוח של זרימת סידן המושרה על ידי קולטן תאי T בתאי T מורין ראשוניים על ידי ציטומטריית זרימה ספקטרום מלא

כאן, אנו מספקים פרוטוקול מקיף לפתרון אותות Ca2+ מקומיים ראשוניים, המכונים מיקרו-דומיינים Ca2+ , בתאי מורין ראשוניים ובתאי T אנושיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי. פרוטוקול זה משמש כמשאב רב ערך לחוקרים הבוחנים מסלולי איתות Ca2+ בתוך תאי מערכת החיסון ולפענח עוד יותר את תפקודם.

הדמיה ראשונית של מיקרודומיינים Ca2+ בתאי T ראשוניים

מאמר זה מציג שיטה לניטור כמותי בזמן אמת של ריכוזי יוני סידן (Ca2+) בתאים באמצעות הדמיה חד-תאית Ca2+ עם צבע Fura-2/AM. טכניקה זו מאפשרת העמסת צבע יעילה וחישוב מדויק של רמות Ca2+ באמצעות יחסי עוצמת פלואורסצנטיות, מה שהופך אותה לגישה פשוטה ומהירה ליישומי מחקר.

דימות סידן חד-תאי לחקר הפעלת תעלות יוני סידן

למדו כיצד להקליט זרמי סידן CRAC בתאי T אנושיים באמצעות טכניקת whole-cell patch clamp. שיטה זו מאפשרת מדידות אמינות של פעילות ערוצי סידן לחקר תפקוד תאי T ומחלות אוטואימוניות.

Whole Cell-הקלטה של ​​סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T

גלה סרטונים נוספים

Whole Cell-הקלטה של סידן סידן שחרור פעילה (CRAC) זרמים האדם לימפוציטים-T