פפטידים מהספרייה תצוגה phage לווסת את ביטוי הגנים בתאים mesenchymal ו להגביר Osteogenesis ב פגמים עצם Unicortical
10 בדצמבר 2010
ספריה התצוגה phage שימש לזהות רצפי פפטיד כי עצם היעד. המטרה היתה לחקור את ההשפעה של פפטידים אלו על התמיינות תאים mesenchymal ולקבוע את השפעתם על התחדשות העצם.
המטרה הכוללת של ניסוי זה היא לזהות רצפים המעצימים את התמיינות התאים המזנכימליים ומקדמים תיקון עצם. השלב הראשוני הוא לבודד על ידי ביופ פאנינג של הפאג' שנקשר לעצם. המשך לזהות את רצפי הפפטידים הנקשרים לתאים מזנכימליים, וגם לקבוע את השינויים הבאים בביטוי הגנים.
בצע ניסויים כדי לקבוע כיצד ניתן להעביר את רצפי הפפטידים לעצם למטרות התחדשות. כשלב אחרון, לבחון תיקון עצם מבחינה היסטולוגית יחד התוצאות יכולות להציע תובנות חשובות לגבי מנגנוני התמיינות תאים במבחנה ותיקון עצם in vivo. היתרונות של שימוש בטכניקת פאנינג ביופ עם ספריית תצוגה של פאג'ים הם שהצלחנו לזהות פפטידים המכוונים לעצם וניתן להשתמש בהם כדי לעורר את ההתמיינות של תאים מזנכימליים ולהגביר את תיקון העצם.
בסופו של דבר, רצפי פפטידים אלה עשויים להיות שימושיים בשיטות טיפוליות לתיקון עצם ולטיפול באובדן עצם כגון אוסטאופניה ואוסטאופורוזיס. בהתבסס על מחקר שבו ULA ופסקל הראו שניתן להשתמש ב-biop panning כדי לבודד רצפי פפטידים המכוונים לכלי דם, בחרנו להתאים שיטה זו לשאילתות מנגנונים בעצם. עבור הליך פאנינג ביופ in vivo, הועבר 10 פעמים 10 ליחידות ביצוע הפלאק העשירי של ספריית הפפטידים של תצוגת הפאג'ים N-E-B-P-H-D 12 דרך ליבו של עכבר שסתום C בן 10 שבועות.
לאחר כחמש דקות יש להמית את העכבר, לחשוף ולנתח את עצם הירך, לחתוך את הקצוות ולהסיר את מח העצם. שטפו את עצם הירך השמאלית מבפנים ומבחוץ עם PBS 10 פעמים. לאחר מכן הוסף את העצם לחיידקי ER 2 5 3 7.
על מנת להסיר פאג'ים לא קשורים, השתמש בחלב דל שומן מיובש 2% במזרק עם מחט בגודל 21 כדי לשטוף את תעלת הביניים של עצם הירך הימנית 10 פעמים. כעת הסר את הפאג' הקשור מתעלת הביניים עם חומצה הידרוכלורית גליצין מאגר. pH 2.2 מנוטרל עם mo la triss אחד.
כדי להגביר את הפאג', הוסף EIT לחיידקי ER 2 5 3 7 ותרבית למשך 4.5 שעות. העבירו בזהירות את הסופרנטנטים לצינורות טריים וזרזו את הפאג' שלוש פעמים על ידי תוספת של פוליאתילן גליקול. תמיסת נתרן כלורי, דגירה על הצינורות למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס.
לבסוף, השעו מחדש את הגלולה ב-TBS עם 0.02% נתרן אזיד. רובד את הפאג' על צלחות כדי לקבוע את יחידות יצירת הפלאק של ה-EITs המוגברים. חזור על הליך ה-in vivo bio panning עבור הפאג' החמקמק והלא מנומק ארבע פעמים.
להגביר פאג'ים מאוגדים בתרביות חיידקים. טהר וכימת את רצף ה-DNA, ה-DNA הסופי של הפאג'ים באמצעות פריימר 98 המסופק עם ערכת תצוגת הפאג'ים. חשוב לחשב את תדירות ייצוג רצף ה-DNA של הפאג'ים.
כעת מסנתזים פפטידים המשלבים זרעי רצף ליזין גליצין, גליצין, סינוס, ליזין ומגבירים תאי D one. קו תאי סטרומה מרובה פוטנציאל של מח עצם משובט שפותח במעבדה שלנו במפגש של 90%. טריפסין הוא התאים והצנטריפוגה לגלולה ולספור תאי צלחת מכתים פפטידים על תא מצופה ג'לטין באר שקופיות ותרבית למשך 24 שעות.
שוטפים את התאים עם PBS ומתקנים עם 4% פרלדהיד למשך 30 דקות. כעת בצע דגירה חוסמת עם גליצין ואחריו BSA Aden ו-BBSA. פתרונות לחסימת ביוטין.
הוסף 100 מיקרומולר של פפטידים ביוטיניליים L, שבע ו-R אחד. המשך לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS למשך חמש דקות כל אחד. יש להוסיף דילול של 1 עד 1000 של מכסה ונייר כסף של LOR ולדגור במגירה חשוכה למשך 30 דקות.
שטפו את התאים והרכיבו את החלקות הכיסוי עם מגן וקטורי מדיית הרכבה. כעת נתח את השקופיות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי 24 שעות לפני הניתוח. משרים את גלילי קצף הג'ל.
העבירו את גלילי קצף הג'ל עם 20 פפטיד מיקרומולר או L שבע או R אחד או מאגר PBS ללא פפטיד לסטרילי 12. ובכן, תרבית כלים ומקרר למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בזמן הניתוח. יש להניח את הקומפוזיט של טלפון הג'ל על קרח עד לשימוש.
בעזרת בור פנאומטי מתחת להשקיה מלוחה, צור פגם חד קליפת המוח המלבני הגדול ברוחב שלושה מילימטרים על אורך שמונה מילימטרים. טפל בפגם העצם עם קצף ג'ל מוכן על ידי החדרת כל הפיגומים המושתלים באמצעות הקשה עדינה. המתת חסד של החולדות ואיסוף השוקה בנקודות זמן מוגדרות, בדוק בזהירות את הפגם בעצם וקבע את השוקה שנקטפה בפורמלין ניטרלי של 10% לחיתוך פרפין.
לבסוף, צבעו את כל חלקי הרקמה בהמטין אאוזין כדי לתייג את מטריצת האוסטאו. פלואורסצאין איזותיוציאנט המסומן עדן מאפשר זיהוי מיקרוסקופי של קשירת פפטידים על תאים הגדלים במבחנה. כאן, הפפטידים נקשרים לתאים מזנכימליים בתרבית כדי לקבוע את ההשפעה האוסטיאוגנית של פפטידים על התאים.
ניתן לטפל בתאים מזנכימליים במבחנה בתרבית באמצעות פפטידי בדיקה כדי לקבוע שינויים במורפולוגיה של התא. לדוגמה, ביום הרביעי, התאים מתחילים להצטבר והצבירים גדלים עם הזמן ליצירת גושים. מעניין שקטע העצם מוכתם באוטופלואורסצנטיות h ו-e תחת אור UV.
ניגודיות גדולה יותר זו בין רקמות עצם לרקמות שאינן עצם מאפשרת ניתוחים לכמת את נוכחות העצם בחלקים כדי לקבוע תיקון עצם בפגמים המטופלים בקצף ג'ל בתוספת פפטיד. בהשוואה לקצף ג'ל בלבד כאן, פגמים שמולאו בתוספת פפטיד הראו את הכמות הגדולה ביותר של תיקון קליפת המוח עם הזמן תוך כדי ניסיון הליך זה. חשוב להיות שיטתי ביותר בהזנת הנתונים שלך בגלל המספר הגדול של דגימות שתמיד יצטברו לאורך זמן עד שתבחר את קבוצת הפפטידים הסופית.
הפיתוח של in vivo biop panning כטכניקה לזיהוי פפטידים המכוונים לעצם פירושו שיש לנו כעת תרופות פוטנציאליות שיכולות לשמש כטיפול לתיקון עצם ולאובדן עצם. אחד המנגנונים העומדים בבסיס תיקון העצם מעורב גם באובדן עצם. הבנת המנגנונים הללו ביתר פירוט וכלים שיכולים לשמש לטיפול בהפרעות כמו שברים מעוכבים ואוסטאופורוזיס יסייעו בשיפור הטיפולים שניתן לתכנן לשירותי בריאות.
סקירה
מחקר זה חוקר רצפי פפטידים שמכוונים לעצם ואת השפעותיהם על התמיינות תאים מזנכימליים והתחדשות עצם. באמצעות ספריית תצוגת פאג, המחקר מטרתו לזהות פפטידים שיכולים לשפר מנגנוני תיקון עצם.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- התחדשות עצם
- התמיינות תאים מזנכימליים
- טכנולוגיית תצוגת פאג
רקע
- תיקון עצם קריטי לטיפול במצבים כמו אוסטאופניה ואוסטאופורוזיס.
- זיהוי פפטידים שמכוונים לעצם יכול להוביל לאסטרטגיות טיפוליות חדשות.
- ביופנינג היא טכניקה המשמשת לבידוד רצפי פפטידים ספציפיים.
- הבנת מנגנוני ההתמיינות התאית יכולה לשפר את הרפואה ההתחדשותית.
מטרת המחקר
- לזהות רצפי פפטידים שמקדמים התמיינות תאים מזנכימליים.
- להעריך את הפוטנציאל של פפטידים אלו בשיפור תיקון העצם.
- לחקור את שיטות ההעברה של הפפטידים האלו לרקמת העצם.
שיטות ששימשו
- ביופנינג in vivo לבידוד פאג הנקשר לעצם.
- ניתוח ביטוי גנים של תאים מזנכימליים שטופלו בפפטידים שזוהו.
- בדיקה היסטולוגית של תיקון עצם בפגמים שטופלו.
- ניתוח מיקרוסקופי של קישור פפטיד לתאים בתרבית.
תוצאות עיקריות
- זיהוי פפטידים שמתחברים ביעילות לתאים מזנכימליים.
- הוכחת שיפור תיקון עצם בפגמים שטופלו בשלדים טעונים פפטידים.
- תצפית על שינויים במורפולוגיה התאית המעידים על התמיינות אוסטאוגנית.
- ניתוח היסטולוגי אישר עלייה בתיקון קורטיקלי עם טיפול בפפטידים.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי מנגנוני תיקון עצם בתיווך פפטידים.
- לפפטידים שזוהו יש פוטנציאל ליישום טיפולי במצבי אובדן עצם.
- מחקר עתידי יכול להבהיר עוד יותר את התפקיד של הפפטידים האלו בהתחדשות עצם.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
This study demonstrates how phage display-derived peptides can modulate mesenchymal cell differentiation to enhance bone repair, offering a target validation strategy for regenerative therapeutics. The approach supports early discovery by identifying bioactive sequences that potentiate osteogenesis in preclinical models. Such target-de-risking tools improve predictive confidence in bone anabolic pathway modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Identifies peptides that bind bone and modulate mesenchymal cell gene expression, supporting target hypothesis interrogation.
- Operational Value: Enables functional validation of osteogenic targets through alkaline phosphatase activity and nodule formation assays.
- Predictive Value: Increases confidence in lead selection by linking peptide binding to Runx2, Osterix, BSP, and Osteocalcin upregulation.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a reproducible in vitro system to screen peptides for osteogenic potential using mesenchymal cell differentiation readouts.
- Operational Value: Standardizes assay conditions via collagen sponge delivery and histological quantification of cortical repair.
- Scalability Value: Supports phage display library screening for peptide candidates with defined binding and functional outputs.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Demonstrates translational continuity from in vitro mesenchymal differentiation to in vivo unicortical defect repair.
- Operational Value: Uses collagen matrix delivery to enable standardized preclinical testing of peptide therapeutics.
- Risk Mitigation: Reduces mechanistic ambiguity by linking peptide treatment to both gene expression changes and histological bone formation.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization to preclinical validation in bone repair models.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of peptide-mediated mesenchymal cell differentiation and pathway clarification via Runx2/Osterix axis.
- Screening: Enables assay-ready systems for evaluating peptide effects on alkaline phosphatase and mineralization nodules.
- Analytics: Generates quantitative gene expression and histological readouts to compare osteogenic potential across peptide candidates.
- Translational Research: Connects in vitro osteogenic markers to in vivo bone defect repair, supporting preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes phage display as a reusable platform for identifying tissue-targeting peptides across regenerative indications.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Enhances target validation confidence by linking peptide binding to functional osteogenic outcomes.
- Operational Value: Delivers standardized, reproducible readouts for mesenchymal differentiation and bone repair across models.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by de-risking osteoinductive mechanisms early in discovery.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of peptide candidates based on in vitro and in vivo efficacy data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in phage display, peptide synthesis, and mesenchymal cell culture.
- Needs infrastructure for in vivo biopanning, histological staining, and fluorescent microscopy.
- Demands standardization of peptide dosing, collagen scaffold preparation, and defect model surgery.
- Involves adaptation considerations when translating peptide activity across different mesenchymal cell sources or defect models.
- Limited by the need for empirical validation of peptide stability and bioavailability in delivery matrices.
