Name: רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-18T16:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: חקור שיטה ליצירת רקומביננטי רטרו-וירוס לזיהום תאי B ספלניים ממושקעים. השיטה מאפשרת ביטוי יציב של גן AID וניתוח תפקוד גנים באימונולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CK נתמכת על ידי תוכנית קולומביה בוגרת אוניברסיטת. UB הוא בחור של לוקמיה לימפומה וחברה של אמריקה, זכה בפרס החוקר חדש מהקרן לחקר לוקמיה והוא נתמך על ידי הפקולטה באוניברסיטת קולומביה בניו הזנק וקרנות.

1. בידוד הטחול B-לימפוציטים וגירוי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר spleens מתרומת זרע מחסר עכברים 12 בין 2-3 חודשים של גיל. הבידוד של הטחול מבוצעת בתנאים סטריליים האיברים נשמרים באופן זמני מלוחים למאגר קר פוספט (PBS) המכילה 15% נסיוב עוברי שור (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הטחול הוא הועבר לאחר מכן ברדס רקמה סטרילית תרבות הומוגני ב 5 מ"ל של PBS FBS בתוספת 2.5%. מעבירים את homogenate אל צינור בז 15 מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם הומוגני רקמת הטחול ב 1000rpm במשך 10 דקות ב 4 ° C עד גלולה התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant לאחר צנטריפוגה. Resuspend התא גלולה בתא 10 מ"ל דם אדומים (RBC) חיץ תמוגה בטמפרטורת החדר למשך 7 דקות, כדי למנוע זיהום על ידי כדוריות דם אדומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם בסל"ד 1000 למשך 10 דקות ו supernatant למזוג ו resuspend התאים המכיל 10 מ"ל PBS 2.5% FBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר 100 aliquot μL ולספור את התאים בדילול 1:1000 באמצעות hemacytometer תקן באמצעות trypan כחול להוציא את כל התאים המתים. כ 2-30 תאים ניתן להשיג בכל הטחול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה מדגם ב 1000rpm במשך 10 דקות למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה ב -0.5% BSA / PBS המכיל 2mm EDTA בריכוז של 10 7 תאים לכל μL 90. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף אנטי CD43 מצופה נוגדנים חרוזים מגנטיים על התאים במיוחד כדי לאגד הלא B תאים. השתמש 10 חרוזים μL לכל μL 90 (10 7 תאים). מערבבים היטב דגירה על 4 מעלות צלזיוס במשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שתאי סומנו בתווית, לשטוף אותם על ידי הוספת 2.5% FBS / PBS על גבי הצינור. צנטריפוגה מדגם בסל"ד 1000 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למזוג supernatant. Resuspend התאים 0.1% BSA / PBS בריכוז של 10x10 7 תאים לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר טור מיון מגנטי על מפריד מגנטי. מיקום צינור חרוטי ישירות מתחת בעמודה לאסוף את הזרימה דרך לטעון את הטור עם 0.5% 3mL BSA / PBS על הממשלה ולשטוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר נוזלים יש לשטוף זרמו, להחליף עם צינור אוסף חדש. אם המדגם הוא פחות מ 1 מ"ל, להתאים את עוצמת הקול מדגם מ"ל 1 עם 0.5% BSA / PBS / EDTA עומס המדגם בעמודה. טען רק 1 מ"ל המרבי של תאים לכל עמודה ולהשתמש עמודות מרובות במידת הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר התאים פסיבי לזרום דרך העמודה לאסוף את התאים מאוגד בצינור חרוטי תחת העמודה. לשטוף את העמודה 4 פעמים עם 3 מ"ל 0.5% BSA / PBS תוך כדי לאסוף את הזרימה דרך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל זרימה דרך שבה CD43 בתאי B שלילי מנוחה יהיה מועשר. מחק את העמודה. צנטריפוגה זרימה דרך בסל"ד 1000 למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים את supernatant ולהוסיף 10 מ"ל בינוני (15% FCS / + גלוטמין, פן / סטרפטוקוקוס, שאינם חיוניים חומצות אמינו, 50 מיקרומטר Β-ME) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים והתרבות 10 6 תאים לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להמריץ את הצמיחה התפשטות תאים B ו, במוסף בינוני עם נוגדן רקומביננטי IL-4 ו אנטי CD40 כזה הריכוזים הסופיים 20 מיקרוגרם / מ"ל ​​ו - 1 מיקרוגרם / מ"ל, בהתאמה, ולהעביר את התאים בקבוק תרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים לילה. ספירת תאים ו לדלל עד 10 6 תאים לכל מיליליטר, והוסיף IL-4 ו CD40 על פי הצורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התרבות התאים למשך 72 שעות לפני זיהום ויראלי. </li></ol> 2. Transfection של תאים מפיק שימוש בפרוטוקולים הוקמה עבור transfection או באמצעות קטיוני שומנים או סידן פוספט. Transfect 3 צלחת 10 ס"מ לכל לבנות DNA, באמצעות 100 מיקרוגרם פלסמיד דנ"א לכל צלחת. אנו משתמשים באופן שגרתי סידן פוספט transfection שיטה 13, 14 ו - לב titer ויראלי גבוה, כאשר בתוספת chloroquine. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש ב 60% -70% תאים ומחוברות פיניקס כמו תאים המפיק להיות transfected. בספירה זו צריך להיות מפגש תא 5,000,000 תאים לכל צלחת 10 ס"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שעה אחת לפני transfection, להחליף את התקשורת עם התקשורת להשלים טרי צמיחת תאים פיניקס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך צינור eppendorpf סטרילי, לשלב 100 מיקרוגרם של אריזות לבנות DNA, 250 μL של CaCl 2 0.5m, ולהתאים את עוצמת הקול הסופי μL 500 עם מים סטריליים </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה 1 מ"ל, במרץ לערבב את הפתרון הזה עם HNP 500 2X μL בתוך צינור פוליפרופילן 15 מ"ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תערובת זו אפשר לנוח בטמפרטורת החדר למשך 80-10 דקות. במהלך תקופה זו משקע יהוו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת transfection ירידה מבחינת אל התאים בעוד מתערבל המדיום כדי לפזר באופן שווה את התערובת לאורך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה התאים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 12 שעות לאחר transfection, להחליף את תא בינוני עם 8ml להשלים בינוני B הצמיחה ולהחזיר את התאים ל 37 ° C חממה. </li></ol> 3. זיהום של מגורה תאים B הטחול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר supernatant מתאי פיניקס 48hr שלאחר transfection ולהעביר את supernatant דרך 0.2 מיקרון המסנן כדי להסיר כל פסולת התא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 3 מ"ל של נגיף המכיל supernatant עם 3 מ"ל של טרום הפעלת תאים B (כמו שלב 1). כדי לשפר את ספיחה נגיפי אל התאים, להוסיף polybrene בריכוז סופי של 16 מיקרוגרם לכל מ"ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק את התאים על ידי צנטריפוגה בסל"ד 2500 למשך 90 דקות בקצב של 30 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר הסחיטה, דגירה למשך 48-72 שעות נוספות על 37 מעלות צלזיוס, כדי לאפשר גדילת התא התפוצה. </li></ol> 4. Cytometry זרימה ניתוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש cytometer זרימה, לנתח את התאים לביטוי פני השטח של IgG1 B220 ו - פני השטח. הנוכחות של IgG1 על פני השטח של התאים עולה כי הבורר רקומבינציה בכיתה אירעה כתוצאה חילוץ מוצלח באמצעות השלמה retroviral של הגן AID. </li></ol> 5. נציג תוצאות יש לנו להציל בהצלחה מחסור של חלבון גורם דאמינז הפעלה Cytidine מושרה (AID) מתרומת זרע מחסר (AID-/ -) לימפוציטים-B באמצעות התמרה retroviral. בקצרה, אנחנו שנוצר רטרווירוסים רקומביננטי להביע AID העכבר (המשרתת) חלבון ידי transfecting תאים פיניקס עם PMX-GFP משרתת 15-18. וירוסים שנקטפו היו נגועים לתוך AID מחסר בתאי B המתקבל AID מחסר עכברים רקומבינציה לשעבר vivo בכיתה מתג (CSR) התנאים גירוי 19. התאים הנגועים ב נותחו לאחר מכן עבור אל CSR IgG1 לאחר 72hrs בתרבות באמצעות ניתוח תזרים cytometry. איור 2 מציג את הזיהוי של IgG1 על פני השטח של תאים B עם תרומת זרע, אך לא לבנות ריק, המציין כי CSR אירעה כתוצאה הצלה ביטוי AID. <img src="/files/ftp_upload/2371/2371fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> איור 1: תוכנית של אריזות retroviral בתוך התאים מפיק: Gene של עניין, המיוצגים על ידי Ψ, היה subcloned לתוך PMX-IRES-GFP, כפי שתואר לעיל 15. הפלסמיד היה transfected לתוך קו אריזה ecotropic ויראלי תא מסוגל לייצר איסור הפרסום-pol וחלבון המעטפה (פניקס, Orbigen), באמצעות שיטת סידן פוספט 13, 14. ארבעים ושמונה שעות לאחר transfection, supernatant חלקיקים נגיפיים המכיל נאסף על זיהום לתוך היעד העיקרי בתאי B שהתקבלו בעכברים. <img src="/files/ftp_upload/2371/2371fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2: חסר AID תאים B, מגורה עם אנטי CD40 ו - IL-4 נדבקו רטרווירוס המכיל PMX-GFP משרתת או רטרווירוס להביע GFP לבד. רמת אחריות חברתית כדי IgG1 הוערך על ידי ניתוח FACS.

<ol><li>Bartholdy, B., Matthias, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+control+of+B+cell+development+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Transcriptional control of B cell development and function.</a> Gene. 327, 1-23 (2004).</li>
<li>Henderson, A., Calame, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+during+B+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation during B cell development.</a> Annu Rev Immunol. 16, 163-200 (1998).</li>
<li>Graf, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+plasticity+of+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Differentiation plasticity of hematopoietic cells.</a> Blood. 99, 3089-30101 (2002).</li>
<li>Xiao, C., Rajewsky, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+control+in+the+immune+system%3A+basic+principles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">MicroRNA control in the immune system: basic principles.</a> Cell. 136, 26-36 (2009).</li>
<li>Waterston, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+comparative+analysis+of+the+mouse+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and comparative analysis of the mouse genome.</a> Nature. 420, 520-562 (2002).</li>
<li>Griffiths, A. J. F., Miller, J. H., Suzuki, D. T., Lewontin, R. C., Gelbart, W. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aGriffiths%2C+AJF+%22Introduction+to+Genetic+Analysis%22">Introduction to Genetic Analysis</a>. , W. H. Freeman. New York. (2000).</li>
<li>Gondo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+gene+targeting+in+the+mouse+for+functional+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22BMB+Rep%22%5BJournal%5D)">Next-generation gene targeting in the mouse for functional genomics.</a> BMB Rep. 42, 315-3123 (2009).</li>
<li>Plachy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proviruses+selected+for+high+and+stable+expression+of+transduced+genes+accumulate+in+broadly+transcribed+genome+areas%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Proviruses selected for high and stable expression of transduced genes accumulate in broadly transcribed genome areas.</a> J Virol. 84, 4204-4211 (2010).</li>
<li>Felice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+factor+binding+sites+are+genetic+determinants+of+retroviral+integration+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Transcription factor binding sites are genetic determinants of retroviral integration in the human genome.</a> PLoS One. 4, e4571-e4571 (2009).</li>
<li>Karavanas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+targeting+by+murine+retroviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Oncol+Hematol%22%5BJournal%5D)">Cell targeting by murine retroviral vectors.</a> Crit Rev Oncol Hematol. 28, 7-30 (1998).</li>
<li>Noelle, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+39-kDa+protein+on+activated+helper+T+cells+binds+CD40+and+transduces+the+signal+for+cognate+activation+of+B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A 39-kDa protein on activated helper T cells binds CD40 and transduces the signal for cognate activation of B cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 6550-6554 (1992).</li>
<li>Muramatsu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Class+switch+recombination+and+hypermutation+require+activation-induced+cytidine+deaminase+%28AID%29%2C+a+potential+RNA+editing+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Class switch recombination and hypermutation require activation-induced cytidine deaminase (AID), a potential RNA editing enzyme.</a> Cell. 102, 553-563 (2000).</li>
<li>Yelle, J., Dion, M., Hamelin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+transfection+of+mammalian+cells+with+viral+DNA+in+optimal+culture+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Efficient transfection of mammalian cells with viral DNA in optimal culture conditions.</a> J Virol Methods. 7, 321-326 (1983).</li>
<li>Chen, C., Okayama, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+transformation+of+mammalian+cells+by+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA.</a> Mol Cell Biol. 7, 2745-2752 (1987).</li>
<li>Fagarasan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+class+switching+and+differentiation+to+IgA-producing+cells+in+the+gut+lamina+propria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In situ class switching and differentiation to IgA-producing cells in the gut lamina propria.</a> Nature. 413, 639-6343 (2001).</li>
<li>Basu, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+AID+antibody+diversification+enzyme+is+regulated+by+protein+kinase+A+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The AID antibody diversification enzyme is regulated by protein kinase A phosphorylation.</a> Nature. 438, 508-5011 (2005).</li>
<li>McBride, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+class+switch+recombination+and+somatic+mutation+by+AID+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Regulation of class switch recombination and somatic mutation by AID phosphorylation.</a> J Exp Med. 205, 2585-2594 (2008).</li>
<li>Barreto, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AID+from+bony+fish+catalyzes+class+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">AID from bony fish catalyzes class switch recombination.</a> J Exp Med. 202, 733-738 (2005).</li>
<li>Delphin, S., Stavnezer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+antibody+class+switching+to+IgE%3A+characterization+of+an+IL-4-responsive+region+in+the+immunoglobulin+heavy-chain+germline+epsilon+promoter%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+N+Y+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Regulation of antibody class switching to IgE: characterization of an IL-4-responsive region in the immunoglobulin heavy-chain germline epsilon promoter.</a> Ann N Y Acad Sci. 764, 123-135 (1995).</li>
<li>Castigli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD40+expression+and+function+in+murine+B+cell+ontogeny%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunol%22%5BJournal%5D)">CD40 expression and function in murine B cell ontogeny.</a> Int Immunol. 8, 405-411 (1996).</li>
<li>Ballantyne, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+recombination+of+a+switch+substrate+retrovector+in+CD40-+activated+B+lymphocytes%3A+implications+for+the+control+of+CH+gene+switch+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Efficient recombination of a switch substrate retrovector in CD40- activated B lymphocytes: implications for the control of CH gene switch recombination.</a> J Immunol. 161, 1336-1347 (1998).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

התמרה retroviral של תאים B הטחול כפי שתואר כאן, כמתואר באיור 1 היא גישה גנטית שימושי במחקר של לימפוציטים-B כי רבים מן האירועים התפתחותיים lymphopoesis נשלטים על ידי תקנה תעתיק 1, 2. בשלבים מאוחרים יותר של ההתבגרות תא B, מפעילה באמצעות CD40L חיוני לזירוז הצמיחה תא B, הכניסה מחזור התא, ושגשוגם 11, 20. כפי שניתן לראות בתרשים 2, תאים B יכול להיות מגורה במבחנה עם אנטי CD40 ו IL4 לעבור את זה פרץ של התפשטות, וקטורים retroviral הם כל...

<table><tbody><tr><td>FCS</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11550</td><td></td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>22400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>20012</td><td></td></tr><tr><td>בופר להמסת (lysis) כדוריות דם אדומות (RBC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R7757</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי CD43</td><td>Miltenyi Biotec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מילה מלאה לתרבית תאי B</td><td>שונים</td><td>רכיבים שונים</td><td>RPMI, 15% FCS, 1% חומצות אמינו שאינן חיוניות, 1% Sodium Pyruvate, 1% HEPES, 1% Pen-Strep, 50&amp;#x03BC;M &amp;#946;-Mercapt&amp;#8211;thanol</td></tr><tr><td>IL-4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD40</td><td>BD Biosciences</td><td>553787</td><td></td></tr><tr><td>polybrene</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>107689 &amp;#8232;</td><td></td></tr><tr><td>מלח Chloroquine diphosphate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6628</td><td>בשימוש בריכוז 100mM</td></tr><tr><td>תאי Ph&amp;#8211;nix Eco (עכבריים)</td><td>Orbigen</td><td>RVC-10002</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5-&amp;alpha;-mouse-CD45R (B220)</td><td>eBioscience</td><td>15-0452-81</td><td></td></tr><tr><td>PE-&amp;alpha;-mouse-IgG1</td><td>BD Biosciences</td><td>A85-1</td><td></td></tr></tbody></table>

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים b

Recombinant Retroviral Production and Infection of B Cells

הביטוי מהונדס של גנים בתאים אוקריוטים היא גישה חזקה גנטית הפוכה שבה הגן של עניין מתבטא בשליטה של ​​מערכת ביטוי Heterologous כדי להקל על ניתוח של פנוטיפ שהתקבל. גישה זו ניתן להשתמש כדי לבטא את הגן כי לא נמצא בדרך כלל האורגניזם, להביע את טופס מוטציה של מוצר הגן, או יתר להביע בצורה דומיננטית שלילית של המוצר גן. זה שימושי במיוחד במחקר של מערכת hematopoetic, שבה תקנה תעתיק הוא מנגנון בקרה מרכזי בהתפתחות והתמיינות של תאים B 1, הנסקרת ב 2-4. עכבר הגנטיקה הוא כלי רב עוצמה ללימוד גנים מחלות אנושיות. ניתוח השוואתי של העכבר הגנום האנושי מגלה שימור synteny של מעל 90% של הגנום 5. כמו כן, רוב הטכנולוגיה שבה נעשה שימוש במודלים של העכבר הוא ישים בחקר הגנים האנושיים, למשל, שיבושים גנים החלפת allelic 6 . עם זאת, יצירה של עכבר מהונדס דורש מידה רבה של משאבי הטבע הן כספי וטכני. מספר פרויקטים כבר החלו לאסוף ספריות של לדפוק את זני העכבר (KOMP, EUCOMM, NorCOMM) או mutagenesis זנים המושרה (RIKEN), אשר דורשים בקנה מידה גדול מאמצים ושיתוף פעולה 7. לכן, רצוי קודם ללמוד את הפנוטיפ של הגן הרצוי במודל התא התרבות של תאים ראשוניים לפני שממשיך במודל של עכברים. ה-DNA retroviral משתלב ה-DNA המארח, רצוי בתוך או ליד יחידות שעתוק או איים CPG, והתוצאה היא יציבה תורשתי הביטוי של הגן ארוז עניין תוך הימנעות השתקה תעתיק 8 9. הגנים מתועתקים אז בשליטת מקדם יעילות גבוהה retroviral, וכתוצאה מכך יעילות גבוהה של שעתוק וייצור חלבונים. לכן, הביטוי retroviral ניתן להשתמש בתאים שקשה transfect, ובלבד התאים נמצאים במצב פעיל במהלך מיטוזה. מכיוון גנים מבניים של הנגיף נמצאים בתוך הקו תא אריזה, וקטורים ביטוי בשימוש לשבט את הגן של עניין אינם מכילים גנים מבניים של הנגיף, אשר שניהם מבטלת את האפשרות של revertants ויראלי מגביר את בטיחות של עבודה עם supernatants ויראלי כמו virions לא זיהומיות מיוצרים 10. כאן אנו מציגים פרוטוקול לייצור רקומביננטי retroviral זיהום הבאות של תאים B הטחול. לאחר הבידוד, התאים בתרבית הם הטחול מגורה עם lymphokines נגזר ה &#39;אנטי CD40, אשר מעוררת פרץ של התפשטות תאים B ו בידול 11. פרוטוקול זה הוא אידיאלי ללימוד אירועים המתרחשים מאוחר בהתפתחות התא B ו בידול, כמו תאים B מבודדים הטחול בעקבות האירועים hematopoetic הראשונית אבל לפני גירוי antigenic להשרות התמיינות plasmacytic.

מערכת יעילה של מבנה וניתוח פונקציה של גן ב<em&gt; לשעבר vivo</em&gt; התרבות של לימפוציטים-B הטחול מתואר. שיטה זו מנצלת את ייצור רקומביננטי retroviral ב חופשית עוזר, קו אריזה ecotrophic התא. יציבה, תורשתי הביטוי של הגן של עניין בתוך לימפוציטים העיקרית היא להשיג מוביל לדור של נוגדנים על פני תאים B עוברת לעבור רקומבינציה בכיתה.

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

ביטוי טרנסגני של גנים בתאים איקריוטיים הוא גישה גנטית הפוכה רבת עוצמה, שבה גן של עניין מובטא תחת בקרה של...

המטרה הכללית של הליך זה היא ביטוי יציב ומעביר של גן מטרה. במקרה זה, מדובר בווסת החלפת הסוג (class switch regulator) AID בתוך לימפוציטים B ראשוניים מעכברים החסרים גן זה; תאי B מהטחול נאספים, מטוהרים ומופעלים באמצעות anti CD 40 ו-IL four. מבנה (construct) המקודד ל-AID מועבר (transfected) לשורת תאי אריזה כדי לייצר חלקיקים ויראליים המכילים את הגן. לאחר מכן, תאי ה-B שהופעלו מודבקים על ידי הרטרו-וירוס הרקומיננטי שיוצר על ידי תאי האריזה.לאחר מכן, התאים מתורגבים למשך 47 עד 72 שעות נוספות כדי לאפשר צמיחה, שגשוג וביטוי של הקונסטרוקט שהוכנס. לבסוף, התאים נצבעים ונבדקים באמצעות ציטומטריה של זרימה (flow cytometry) לנוכחות של נוגדנים שטח שעברו החלפת מחלקה (class switch). היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון מודלים של עכברים, הוא שהיא דורשת משאבים כספיים וטכניים פחותים משמעותית, תוך שהיא מספקת מערכת יעילה לניתוח מבנה ותפקוד של הגן הנבדק, תוך שימוש בטכניקת סטריליזציה קפדנית.קצרו את הטחול מעכברים חסרי ID בני שלושה עד שישה חודשים, ואחסרו את האיברים ב-PBS קר המכיל 15% FBS על קרח עד להשלמת קצירת כל הטחולים. הומוגניזו את הטחול על ידי דחיפת הרקמה דרך מסננת רשת המונחת על פלטת 6 בארות המכילה חמישה מיליליטר של PBS המועשר ב-2.5% FBS. העבירו את ההומוגנאט למבחנת פלקון של 15 מיליליטר וסובבו את הרקמה ההומוגנית בצנטריפוגה בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס ובמהירות של 1000 RPM למשך 10 דקות. שפכו את הנוזל העליון (supernatant) ונערו קלות את המבחנה כדי לשחרר את התאים.שקע את התאים על ידי צנטריפוגה, השהה אותם ב-10 מיליליטר של בופר להמסה של תאי דם אדומים (red blood cell lysis buffer) והדגר את התערובת בטמפרטורת החדר למשך שבע דקות. כדי למנוע זיהום על ידי תאי דם אדומים, סובב את התאים המומסים בצנטריפוגה לצורך שטיפה ושפוך את הנוזל העליון (supernatant). השהה את המשקע ב-10 מיליליטר של PBS המכיל 2.5% FBS, וספור את התאים בדילול של 1 ל-1000 באמצעות המוציטומטר (hemocytometer) סטנדרטי, תוך שימוש ב-trypan blue כדי להחריג תאים מתים.ניתן להפיק כ-20 עד 30 מיליון תאים לטחול; סנטריפוגו את התאים פעם נוספת וסספנדו אותם ב-0.5% B-S-A-P-B-S המכיל two millimolar EDTA בריכוז של 10 מיליון תאים ל-90 microliters. הוסיפו לתאים חרוזיים מגנטיים מצופים בנוגדן anti CD 43 כדי לקשור באופן ספציפי תאים שאינם תאי B. השתמשו ב-10 microliters לכל 10 מיליון תאים.ערבב היטב והדגר את התאים לצורך סימון בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. לאחר סימון התאים, שטוף אותם על ידי מילוי השפופרה ב-2.5%F-B-S-P-B-S וצנטריפוגציה של הדגימה. לאחר הסרת הנוזל העליון, השהה את התאים בריכוז של 100 מיליון למילילטר ב-0.5%B-S-A-P-B-S המכיל EDTA והרכב עמודת מיון מגנטית על מפריד מגנטי.מקמו מבחנה קונית ישירות מתחת לעמודה כדי לאסוף את הנוזל העובר, וטענו את העמודה בשלושה מיליליטר של 0.5%B-S-A-P-B-S קר לצורך הפעלה ושטיפה. לאחר שנוזל השטיפה עבר, טענו את הדגימה אל העמודה; טענו רק מיליליטר אחד של תאים לכל עמודה והשתמשו במספר עמודות במידת הצורך. אפשרו לתאים לזרום באופן פסיבי דרך העמודה ואספו את התאים שאינם קשורים למבחנה הקונית שמתחת לעמודה.שטפו את העמודה ארבע פעמים עם 3 mL של 0.5% B-S-A-P-B-S תוך כדי המשך איסוף של התסננת (flow through). לאחר שטיפת העמודה, ניתן להשליכה. שמרו את התסננת שבה יועשרו תאי B במצב מנוחה שהם CD 43 שליליים.סבבו בצנטריפוגה את הנוזל שעבר (flow through) ושחזרו את המשקע ב-10 milliliters של מצע RPMI מלא. ספרו את התאים והתאימו את נפח המצע כדי להגיע לריכוז של 1 מיליון תאים ל-milliliter, במטרה לעודד צמיחה ושגשוג של תאי B.הוסיפו למצע recombinant IL-4 ונוגדן anti-CD40 כך שהריכוזים הסופיים יהיו 20 µg/mL ו-1 µg/mL בהתאמה, והעבירו את התאים לבקבוק תרבית. דגרו את התרבית למשך 72 שעות, תוך פיצול יומי של התאים למצע המולווה ב-IL-4 ובנוגדן anti-CD40 כדי לשמור על ריכוז תאים של 1 מיליון תאים למל'. השתמשו בתאי phoenix עם התמסרות (confluence) של 60% עד 70% כתאי יצרן לצורך טרנספקציה; ברמת התמסרות זו, מספר התאים צריך להיות 5 מיליון תאים לצלחת של 10 cm, שעה אחת לפני הטרנספקציה.החליפו את המצע במצע שלם טרי לצמיחת תאי Phoenix במבחנת איינור סטרילית. הוסיפו 100 micrograms של DNA של קונסטרוקט האריזה ו-250 microliters של calcium chloride בריכוז 0.5 molar, והביאו את הנפח הסופי ל-500 microliters באמצעות מים סטריליים. השתמשו בפיפט של one milliliter בנעורה חזקה.ערבב תמיסה זו עם 500 µL של two XHNP בתוך מבחנה פוליפרופילן בנפח 15 mL. הנח לתערובת זו לנוח בטמפרטורת החדר למשך 8 עד 10 דקות. במהלך זמן זה ייווצר משקע; הוסף את תערובת הטרנספקציה בטיפות לתאים תוך כדי ערבוב סיבובי של המצע כדי להפיץ את התערובת באופן אחיד.דגרו את התאים בטמפרטורה של 37 °C למשך 12 שעות או 24 שעות לאחר הטרנספקציה. החליפו את המצע בשמונה מיליליטר של מצע גידול מלא לתאי B.לאחר מכן, החזירו את התאים למדגרה בטמפרטורה של 37 degrees Celsius. 48 שעות לאחר הטרנספקציה, אספו את העלייה (supernatant), שאמורה להכיל כעת וירוסים. סננו את העלייה דרך מסנן של 0.45 micron כדי להסיר שאריות תאים. ערבבו שלושה milliliters של העלייה המכילה וירוסים עם שלושה milliliters של תאי B שהופעלו מראש מהתרבית שתוארה קודם לכן, המכילה 1 million תאים ל-milliliter, וזאת כדי להגביר את ספיגת הווירוסים לתאים.הוסיפו poly brain בריכוז סופי של 16 µg/mL. הדביקו את התאים על ידי סבב צנטריפוגה של התערובת במהירות של 2,500 RPM למשך 90 דקות בטמפרטורה של 30 °C; הוציאו את הדגימה מיד לאחר הסבב. דגרו למשך 48 עד 72 שעות נוספות בטמפרטורה של 37 °C כדי לאפשר לצמיחה ולהתרבות של התאים.באמצעות ציטומטר זרימה (flow cytometer), נתוח את התאים לבדיקת ביטוי על פני השטח של B two 20 ו-IgG one. נוכחות של IgG one על פני שטח התאים מעידה על כך שפעולת recombinaton של החלפת מחלקה (class switch recombination) התרחשה כתוצאה מהצלה מוצלחת באמצעות השלמה רטרו-ויראלית של הגן a ID. גרף זה מראה זיהוי של IgG one על פני שטח של תאי B עם a ID, אך לא עם המבנה הריק (empty construct), מה שמעיד על כך ש-class switch recombination התרחשה כתוצאה מהצלת a ID.זכרו שעבודה עם רטרו-וירוס רקומביננטי עלולה להיות מסוכנת, ויש לנקוט תמיד באמצעי זהירות, כגון הקפדה על הנחיות המוסד הרלוונטי, בעת ביצוע הליך זה.

recombinant-retroviral-production-and-infection-of-b-cells

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

טכניקה זו ממחישה דרך יעילה כדי להכין את השכפול פגום מניות retroviral קידוד oncogene אדם, לאחר מכן נעשה שימוש לזירוז המחלה myeloproliferative במודל עכבר.

הפקה של רטרווירוס שכפול פגומים-by transfection חלוף של תאים 293T

שיטה להכנת תאים חרקים להדביק אותם עם baculovirus לצורך הייצור של proteinand רקומביננטי mCD1d יצירת tetramers mCD1d.

שיטה לייצור של חלבון רקומביננטי mCD1d בתוך תאים חרקים.

אנו מציגים פרוטוקול לייצר אנטיגן ספציפי עכבר מתאי T באמצעות התמרה...

התמרה retroviral של T-cell קולטנים עכבר מתאי T

פרוטוקול מהיר, פשוט וחסכוני עבור הדור של התורם הנגזרות multivirus ספציפי ההרג (rCTL) עבור עירוי כדי allogeneic hematopoietic בתאי גזע להשתלה (HSCT) מקבלי בסיכון לפתח זיהומים CMV, עו"ד או EBV. תהליך הייצור GMP תואמי וצריך להבטיח את יישום רחב יותר של חיסוני T-cell מעבר במרכזים מיוחדים.

דור Multivirus ספציפיים תאים T כדי למנוע / לטפל זיהומים נגיפיים לאחר השתלת allogeneic תא גזע hematopoietic

אנו מתארים פרוטוקול להגברת אתרי אינטגרציה רטרו-ויראלית מה-DNA הגנומי של תאים נגועים, ריצוף הצמתים המוגברים של הווירוס-מארח ולאחר מכן מיפוי רצפים אלה לגנום ייחוס. אנו מתארים גם טכניקות לכימות התפלגות אתרי האינטגרציה ביחס להערות גנומיות שונות באמצעות BEDTools.

הגברה, רצף הדור הבא, ואת הגנום מיפוי ה- DNA של אתרי אינטגרצית retroviral

בזאת אנו מתארים שיטה חדשנית להפקה לקולטנים המצויים בתאי T אנטיגן ספציפי (TCRs) על ידי התאמת TCRα או TCRβ של TCR קיים, שהוא בעל אנטיגן-הסגולי של עניין, עם hemichain המשלים של רפרטואר קולטן תא ההיקפי T. TCRs שנוצר דה נובו לשמר אנטיגן-סגולי עם משתנה זיקה.

יצירה<em&gt; דה נובו</em&gt; לקולטנים המצויים בתאי אנטיגן ספציפי האדם T על ידי retroviral התמרה של Centric Hemichain

מערכות ניסיוניות רבות כבר נוצלו כדי להבין את המנגנונים המסדירים פיתוח תאי T ולתפקד תגובה חיסונית. הנה גישה גנטית באמצעות תמרת retroviral מתוארת, אשר היא כלכלי, זמן יעיל, והכי חשוב, מאוד אינפורמטיבי בזיהוי מסלולים רגולטוריים.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

במאמר זה, אנו מספקים שפרוטוקול מפורט עבור הביטוי של פיוז'ן פלורסנט חלבונים במח העצם מאתר נגזר התאים הדנדריטים ומקרופגים. השיטה מבוססת על התמרה חושית של מח העצם אבות עם בונה retroviral ואחריו בידול לתוך מקרופאגים, הדנדריטים תאים במבחנה.

ביטוי של חלבונים פיוז'ן פלואורסצנט תאים דנדריטים הנגזרות מח עצם מאתר ו מקרופאגים

אנו מתארים פרוטוקול של 9 ימים עבור התמרה והתרחבות של דם היקפי רזוס מקוק תאים מונמוננקה שתשואות תאים עם ביטוי מעולה של הגנים של העניין במספר מספיק עבור מחקרי אינפוזיה של יעילות התא.

התמרה והרחבה של תאי T ראשוניים בתשעה ימים עם אחזקה של זיכרון מרכזי מושגים

כאן אנו מתארים שיטה של הבעה overexpression והעברה המאמצת של תאים מורנין ב-1a כדי לבחון ב vivo B-1a תא הגירה ולוקליזציה. פרוטוקול זה ניתן להארכה עבור שונים הזרם התפקודי של המטה אומר כולל כימות של לוקליזציה של התורם B-1a או ניתוח של הגורמים הנגזרים לתא התורם הנגזר לאחר העברה המאמצת.

Retroviral ביטוי יתר של CXCR4 על מורנה ב-1a תאים והעברה המאמצת עבור B-1a תא הגירה במח העצם ו IgM הפקה

חקור שיטה ליצירת רקומביננטי רטרו-וירוס לזיהום תאי B ספלניים ממושקעים. השיטה מאפשרת ביטוי יציב של גן AID וניתוח תפקוד גנים באימונולוגיה.

רקומביננטי הפקה זיהום retroviral של תאים B

גלה סרטונים נוספים