Name: אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: למדו כיצד למדוד קינטיקה של ייצוא mRNA גרעיני בתאי יונקים באמצעות מיקרו-הזרקה והכלאה פלואורסצנטית in situ. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק של תנועת mRNA מהגרעין לציטופלזמה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ברצוננו להודות גומז א עצה שימושית וא ויילד עבור ומאפשר לנו להשתמש בציוד שונים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק כדי AFP מן המכון הקנדי לבריאות מחקר (FRN 102,725).

<ol><li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li>
<li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li>
<li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li>
<li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li>
<li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li>
<li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li>
<li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li>
<li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+alignment+of+the+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li>
<li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li>
<li>Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li>
<li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Cotranscriptionality%22%3A+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li>
<li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li>
<li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
<li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Microinjection הוא כלי רב עוצמה שניתן להשתמש בהם כדי ללמוד מספר תהליכים תאיים שונים. בניגוד transfection התא קונבנציונאלי, microinjection מאפשרת לחוקר ביעילות להציג חומצות גרעין לתוך גרעין התא בתוך פרק זמן צר מאוד. כתוצאה מכך, ניתן לבצע ניתוחים הקינטית כגון קביעת שיעורי הייצוא mRNA, לוקליזציה mRNA, ואת סינתזת החלבון. יתר על כן, מאז הזמן של הניסוי היא קצרה יחסית, ניתן לחשוף תאים תרכובות רעילות בתוך בפרקי זמן קצרים ללא גביית תופעות pleiotropic. יתר על כן, מעכבות או גירוי תרכובות כגון חלבונים שלילי דומיננטי, יכול להיות שותף מוזרק עם חומצות גרעין. לבסוף, microinjections למנוע את הדרישה ריאגנטים transfection, אשר לעתים רעיל לתאים ועלול להפריע תפקודים תאיים שונים. mRNA לעומת זריקות ה-DNA פלסמיד הבחירה בה חומצות גרעין להזריק יהיה תלוי מספר שיקולים. בעקבות הזרקת פלסמיד דנ&quot;א, RNA פולימראז II לא רק מסנתז mRNA, אלא גם מגייסת גורמים חלבון תמליל המתהווה 12,13. מאז גורמים אלה חלים אירועים כגון עיבוד mRNA, יצוא גרעיני לוקליזציה cytoplasmic, זריקות DNA פלסמיד יכול לשמש כדי להעריך כיצד הוא תעתיק מצמידים את תהליכי במורד הזרם. למרות שעתוק עשוי להיות יחד לייצא גרעיני 14, מצאנו כי מזריקים mRNA מיוצא מעט מהר יותר מאשר ב-mRNA עיבד vivo 6. הסיבות לכך אינן ברורות כרגע, אך תוצאה זו עשויה לרמוז כמו mRNA מסונתז החדש עולה RNA פולימראז II, זה עשוי להיות קשור מתחמי כי יצוא לעכב גרעיני. יש כמה יתרונות עם זריקות mRNA. ראשית, החוקר לא חייב להשתמש מעכבי RNA פולימראז, אשר עשוי להשפיע על האופן שבו תאים מווסתים את חילוף החומרים הכללי של רנ&quot;א. שנית, RNA יכול להיות שונה במבחנה לפני הזריקה. למשל, mRNAs יכול להיות מסונתז עם כובע &quot;5 אנלוגים שונים או פולי (א) אורך הזנב על מנת להעריך כיצד תכונות אלה משפיעות על הייצוא הגרעיני 6. שלישית, הסכום המדויק של רנ&quot;א מוזרק ניתן להעריך בגסות. בעקבות פרוטוקול שתוארו לעיל, אנו מעריכים כי כ -20,000 עד 50,000 מולקולות מוזרקים בגרעין אחד, שהוא קטן יחסית בהשוואה למספר הכולל של תמלילי בתא יונקים אופייני (400,000 עד 850,000 מולקולות) 15. החיסרון העיקרי עם זריקות mRNA היא כי במהלך microinjection, כמה דליפה של נוזל הזרקה לתוך הציטופלסמה היא בלתי נמנעת. מאז ה-mRNA מוזרק ישירות לתוך הציטופלסמה היא יציבה לאורך תקופות ארוכות (א Palazzo, תצפית לא פורסם), טיפול נוסף יש לנקוט כדי לבחור את התאים לכימות. בדרך כלל אנו מנתחים את התאים שקיבלו&gt; 90% נוזל הזרקה בגרעין, כפי שנבחנו על ידי חלוקת OG-dextran.

<table><tbody><tr><td>בופר הזרקה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>140 mM KCl ו-10 mM HEPES, pH 7.4</td></tr><tr><td>Oregon Green 488-70kD Dextran</td><td>Invitrogen</td><td>D7173</td><td>ניתן לאחסן תמיסת מלאי בריכוז של 10mg/ml בבופר להזרקה למשך תקופות זמן ממושכות בטמפרטורה של 80- מעלות צלזיוס.&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>צינורות קפילריים מבורוסיליקט</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לפיפטה לטעינת ג'ל עבור מחטי הזרקה</td><td>Eppendorf</td><td>022351656</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>מכשירי Nikon</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מניפולטור</td><td>Narishige International</td><td>NT-88-V3MSH</td><td></td></tr><tr><td>מזרק להזרקה</td><td>BD Biosciences</td><td>512311</td><td></td></tr><tr><td>בופר PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, pH 7.4</td></tr><tr><td>בופר SSC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.4</td></tr><tr><td>4% פאראפורמאלדהיד</td><td>מדעי המיקרוסקופיה האלקטרונית</td><td>15686</td><td>מנת מלאי של 37% פראפורמלהיד (Paraformaldehyde) מדוללת ב-PBS</td></tr><tr><td>0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28314</td><td>מלאי של 10% Triton X-100 מדולל ב-PBS</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>דקסטראן סולפט</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>&lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית בשימור (EM)&gt;*E. coli*&lt;/em&gt; tRNA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>קומפלקס ונאדיל ריבוסיד (VRC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3380</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון Whatman</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td></td></tr><tr><td>שולחן לביטול רעידות</td><td>מערכות קינטיות</td><td>5702E-3036-21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-אמניטין (-amanitin)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר למתיחת מיקרופיפטות בשיטת השריפה/בראון (Flaming/Brown Micropipette Puller)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>גריס ואקום</td><td>Dow Corning</td><td>695400008</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA פולימראז</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>פולי(A) פולימראז</td><td>Ambion</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>בופר היברידיזציה</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100mg/ml דקסטראן סולפט, 5mM VRC, 150mM NaCl, 15mM נתרן ציטראט, 0.5mg/ml &lt;מיקרוסקופיה אלקטרונית (EM)&gt;*E. coli*&lt;/em&gt; tRNA, 60% פורממיד</td></tr></tbody></table>

אנליזה של קינטיקה mrna גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי microinjection

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

ב אאוקריוטים, RNA שליח (mRNA) הוא עיבד בגרעין והוא חייב להיות מיוצא לתוך הציטופלסמה לגשת מכונות תרגום. למרות הייצוא הגרעיני של ה-mRNA, נחקרה בהרחבה ב ביציות Xenopus 1 ואורגניזמים ממושמע גנטית כגון שמרים 2 וקו נגזר תסיסנית תא S2 3, מחקרים מעטים נערכו בתאי יונקים. יתר על קינטיקה של הייצוא ב mRNA יונקים תאים סומטיים יכול רק להסיק 4,5 בעקיפין. על מנת למדוד את הקינטיקה הייצוא הגרעיני של mRNA בתאי יונקים תרבות רקמות, פיתחנו assay המעסיקה את כוחו של microinjection יחד עם ניאון הכלאה באתרו (FISH). מבחני אלה היו בשימוש על מנת להוכיח כי בתאי יונקים, רוב mRNAs מיוצאים באופן שחבור תלוי 6,7, או באופן ספציפי הדורש רצפי הרנ&quot;א כגון האזור אות רצף קידוד (SSCR) 6. ב assay זה, התאים microinjected עם או במבחנה mRNA מסונתז או DNA פלסמיד המכיל את הגן של עניין. התאים microinjected מודגרת נקודות זמן שונות קבוע אז הלוקליזציה המשנה הסלולר של RNA הוא הוערכה באמצעות FISH. בניגוד transfection, שם השעתוק מתרחשת מספר שעות לאחר תוספת של חומצות גרעין, microinjection של ה-DNA או mRNA מאפשר ביטוי מהיר ומאפשר הדור של נתונים קינטית מדויקת.

כאן אנו מתארים assay המעסיקה את כוחו של microinjection יחד עם ניאון<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה על מנת למדוד במדויק את הקינטיקה הייצוא הגרעיני של mRNA של יונקים תאים סומטיים.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

באוקריוטים, RNA שליח (mRNA) מותמל בגרעין ויש לייצא אותו אל הציטופלזמה כדי לגשת למכונה התרגומית. למרות ש...

המטרה הכללית של הליך זה היא למדוד את קינטיקת הייצוא הגרעיני של mRNA בתאי יונקים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הזרקה מיקרוסקופית של mRNA או DNA לתוך הגרעינים של תאי תרביות רקמה של יונקים. לאחר ההזרקה המיקרוסקופית, הדגימות מקובעות לאחר תקופות דגירה שונות.לאחר מכן, ה-mRNA נצבע באמצעות היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (fluorescent in situ hybridization) או FISH. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא דימות התאים וכמימות של כמות הפלואורסצנציה בציטופלזמה ובגרעין. בסופו של דבר, ניתן למדוד את קצב ייצוא ה-mRNA באמצעות שילוב של מיקרו-הזרקה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.שלום, אני SRG AV מהמעבדה של אלכס פלאצו (Alex Palazzo) במחלקה לביוכימיה באוניברסיטה של טורונטו. אני סטפן טוסקי (Stefan Toski), גם אני מהמעבדה של פלאצו. אני איימי מהמעבדה של פלאצו ואני חי מהא דוד (Khi Maha David) מהמעבדה של פלאצו.היום נדגים הליך להחדרת mRNA לגרעינים של תאי תרבית רקמה של יונקים באמצעות מיקרו-הזרקה. כמו כן, נדגים כיצד לצבוע את ה-mRNA באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתר (fluorescent in situ hybridization). אנו משתמשים בהליכים אלו במעבדתנו כדי לחקור את קינטיקת הייצוא הגרעיני של mRNA בתאי יונקים.אם כן, נתחיל. לפני תאריך ההזרקה המיקרוסקופית, יש לדלל DNA פלסמי שהוכן מראש לריכוז שבין 50 ל-200 micrograms per milliliter בבופר הזרקה. לאחר מכן, הוסיפו לתערובת Oregon Green 488 או OG המצומד ל-70 kilodalton dextran כדי לאפשר את זיהוי התאים המוזרקים.ה-OG conjugated dextran יעזור לקבוע כמה מהנוזל הוזרק לגרעין וכמה דלף אל הציטופלזמה. סובבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-13,000 G ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות, כדי לשקיע כל חומר חלקיקי שעלול לחסום את קצה המחט. בחרו את שורת התאים של היונקים להזרקה מיקרוסקופית בהתבסס על הקריטריונים המתוארים בפרוטוקול הכתוב.שבעה תאים משמשים לצורך הדגמה זו. התאים מונחים על ליתיות כיסוי שטופות בחומצה בתוך צלחות פטרי של 30 מילימטר לפחות 24 שעות לפני ההזרקה המיקרוסקופית. באופן אידיאלי, שכבת התאים צריכה להיות בערך 70 עד 90% confluent בזמן ההזרקה כדי לאפשר זיהוי קל של התאים המוזרקים; לפני ההזרקה, גורמים לפגיעה בשכבת התאים באמצעות קצה של פיפטת פלסטיק של 200 microliter.חקו פצע בצורת צלב על זכוכית הכיסוי והשאירו את התאים להתאושש באינקובטור לתרביות רקמה למשך 15 דקות לפחות לפני ההזרקה. לביצוע המיקרו-הזרקה, השתמשו במיקרוסקופ הפוך המבודד על שולחן אוויר כדי למזער רעידות שעלולות להפריע לתהליך המיקרו-הזרקה. בעזרת טיפ למטען ג'ל של einor, הסירו כ-1 µL מהחלק העליון של הדגימה בצנטריפוגה כדי למנוע פגיעה במשקע.החדירו את קצה הפפיטה לקצה האחורי של מחט מיקרו-הזרקה מוכנה מראש ופתחו את הנוזל. הנוזל יישאב לתוך קצה המחט באמצעות פעולת נימיות. מניסקוס קרוב לקצה המחט אמור להופיע בתוך חמישה עד 30 שניות.מקמו את המחט המלאה בנוזל בתוך המוט (wand) והצמידו אותה למיקרו-מניפולטור. בזווית של 45 מעלות, צפו במחט באמצעות עדשה של 10x ומקמו אותה במרכז שדה הראייה בקרבת מישור המוקד. באמצעות כפתורי הכוונון הגס של המיקרו-מניפולטור, המוט מחובר באמצעות צינור למזרק זכוכית, המשמש ליצירת הלחץ הדרוש להזרקת הנוזל מקצה המחט.כדי לשמור על לחץ קבוע, המזרק מותקן על תפס צינור. באמצעות שני פקקי גומי ושני תפסים ממתכת, הרימו את המחט מספר מילימטרים כדי למנוע את פגיעתה בשלבים מאוחרים יותר, ולאחר מכן החזירו את המיקרוסקופ לאחור. הגבישו את הלחץ על ידי לחיצה על בוכנת המזרק.0.5 עד שני סמ"ק. הניחו צלחת פטרי המכילה זכוכית כיסוי עם שכבה חד-שכבתי פגועה. על במה הצפייה, הרחיקו את המיקרוסקופ.הזז את העמוד קדימה למצב זקוף, כך שהקונדנסור יהיה מיושר והמחט תוכל לחדור לנוזל. יש לבצע זאת בזהירות כדי למנוע שבירה של המחט על כיסוי הזריקה. באמצעות עדשת אובייקט 10x, זהה את מרכז הפצע בצורת צלב ומקם את המחט מעל התאים המיועדים להזרקה.הגדילו את ההגדלה על ידי מעבר לעדשה אובייקטיבית של 40x. לאחר מכן, הורידו ומרכזו את המחט באמצעות כפתורי הכוונון העדין (fine adjustment) בידית השליטה. התחילו את ההזרקה באחת מפינות צלב הפצע על ידי הורדת המחט עד ליצירת מגע עם הגרעין.לאחר ההזרקה, התא יעבור שינוי ניכר בבהירות המופע (phase brightness). המשיכו לאורך קצה אחד של צלב הפצע. כדי לאפשר זיהוי קל של התאים המוזרקים במהלך ההדמיה, קריטי להתאים כראוי את לחץ ההזרקה עבור כל מחט.הלחץ חייב להיות גבוה מספיק כדי לחדור את קרומי הפלסמה והגרעין, אך לא גבוה מכדי להרוג את התאים. בצעו מיקרו-הזרקה לתאים לאורך קצה הפצע למשך פרק זמן קבוע. עם תרגול, ניתן להזריק מספר מאות תאים במהלך פרק זמן זה.במקרה של הזרקה של פלסמידי DNA, דגרו את התאים שהוזרקו במיקרו-מזרק בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לתרביות רקמה למשך 20 דקות לפני הקיבוע, ולאחר מכן הפסיקו את השעתוק. הדבר נעשה על ידי טיפול בתאים ב-1 µg/mL של $\alpha$-amanitin המומס במצע גידול. ריכוז זה מעכב ביעילות שעתוק מפלסמידים שהוזרקו במיקרו-מזרק.החזירו את התאים לאינקובטור ואפשרו לתאים לייצא את ה-mRNA שסונתז acabado. ניתן להשתמש במחט אחת שוב כדי להזריק למספר זכוכיות כיסוי. עם זאת, יש להחליף את המחט כאשר סוג ה-DNA או ה-RNA המוזרקים במיקרו-הזרקה משתנה.בנוסף, ברגע שהמחט מוסרת מהמקל (wand), יש להשליכה כדי לקבל מדידה מדויקת של קינטיקה של ייצוא mRNA מהגרעין. יש לקבע דגימות נפרדות בנקודות הזמן: 0 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 60 דקות ו-120 דקות. לאחר הטיפול ב-alpha manin בזמן המתאים, שאבו את מצע הגידול ושטפו את התאים פעמיים בשני מיליליטר של תמיסת PBS.חשוב לשמור על כיסויי הזריקה (cover slips) לחים על ידי מזעור הזמן שבו הם אינם טבולים בנוזל. קבעו את התאים על ידי הוספת 2 mL של 4% Aldehyde ב-PBS והדגירו את התאים למשך לפחות 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת הדגימות המקובעות פעמיים נוספות, הפכו את התאים למאוורים (permeable) באמצעות 2 mL של 0.1% Triton X 100 ב-PBS; שוב, הדגירו את התאים למשך לפחות 15 דקות בטמפרטורת החדר.לבסוף, שטפו את הדגימות פעמיים נוספות כדי להכינן אותן להיברידיזציה. שטפו את התאים פעמיים עם תמיסת שטיפה של 1X SSC המכילה 25 עד 60% formamide. לאחר מכן, הכינו את תא הצביעה להיברידיזציה על ידי כיסוי תחתיתו של Petri dish בנפח 150 מילימטר במים והנחת פיסת parafilm מעל פני השטח.הסיר את המים על ידי הפיכת הצלחת, ובכך אפשר ל-paraform להיצמד לתחתית הצלחת. הסר ידנית בועות אוויר מכל זכוכית כיסוי המיועדת לצביעה. טפטף באמצעות פיפטה טיפות של 100 µL מתמיסת ההיברידיזציה על ה-paraform.שימו לב כי יש לבצע אופטימיזציה של כמות ה-formage עבור סוג הדג הספציפי שבו משתמשים, בעזרת פינצטה. הסירו את לביבת הזכוכית עם התאים המקובעים מתוך צלחת הפטרי בקוטר 30 מילימטר. בעזרת נייר סינון Watman, ייבשו את צדו האחורי של לביבת הזכוכית וספחו עודפי באפר מהצד הקדמי מבלי לייבש את התאים.לאחר מכן, הנח את זכוכית הכיסוי כשהצד הפונה כלפי מטה על תמיסת הדגים. חזור על תהליך זה עבור כל זכוכית כיסוי. לאחר החזרת המכסה לתאי הצביעה, דגור את הדגימות למשך חמש עד 18 שעות בטמפרטורה של 37 degrees Celsius.הכינו מספר תאי שטיפה באופן דומה לאופן שבו הוכן תא הצביעה; עבור כל זכוכית כיסוי, טפטפו באמצעות פיפטה 1 mL של תמיסת שטיפה על הפרפורם של תא השטיפה. לאחר האינקובציה, הוציאו את זכוכיות הכיסוי מתא הצביעה על ידי טפטוף של 1 mL של תמיסת שטיפה. הנוזל אמור להישאב אל מתחת לכל דגימה באמצעות פעולת נימיות לצד זכוכית הכיסוי.לאחר מכן, הסר את לביבות הכיסוי באמצעות פינצטה והנח כל אחת מהן על טיפה של חוצץ שטיפה שהודגרה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. שטוף כל לביבת כיסוי פעמיים נוספות, לסך הכל שלושה שטיפות לכל לביבת כיסוי. השתמש בפיפטה כדי להעביר 10 עד 30 µL של תמיסת קיבוע עם dappy על גבי זכוכית ששטופה מראש. כל זכוכית יכולה להכיל שתי לביבות כיסוי; בצע זאת באמצעות פינצטה ונייר סינון watman.ייבשו את גבם של כיסורי הזריקה וספגו נוזלים עודפים מהצד הקדמי של כיסוי הזריקה מבלי לייבש את הדגימות. הניחו כל כיסוי זריקה עם הפנים כלפי מטה על טיפה של תמיסת קיבוע. ניתן לשמור דגימות מקובעות בטמפרטורה של ארבע מעלות Celsius.כאן מוצגות ההשפעות של alpha mantin על תעתוק של DNA פלסמידי מוזרק בתאי פיברובלסט NIH 3T3, אשר טופלו מראש בריכוזים משתנים של alpha mantin. התאים הוזרקו עם TFL s delta i, DNA פלסמידי ו-OG conjugated 70 kilo dextran. כל שורה תואמת לשדה ראייה בודד שצולם עבור OG 70 kilodalton dextran ו-T uts delta I mRNA.ניכר כי ריכוזים גבוהים של התרופה עיכבו לחלוטין את ייצור הטרנסקריפט של T UTS delta I, בעוד שדבר זה לא נצפה בריכוזים נמוכים יותר. מוצג כאן מהלך זמן של עלות ייצוא גרעיני של mRNA. שבעה תאים הוזרקו עם פלסמיד DNA של T UTS delta i ו-dextran בגודל 70 kilodalton מצומד ל-OG.30 דקות לאחר ההזרקה, התאים טופלו ב-alpha mantin והודגרו בטמפרטורה של 37 degrees Celsius למשך zero minutes, 60 minutes ו-120 minutes. לאחר מכן, התאים קובעו ונצבעו באמצעות גשש נגד T UTS delta I mRNA, ובנוסף באמצעות נוגדנים נגד סמן ה-ER trap alpha. כל שורה תואמת לשדה תאים בודד.לקבלת מידע על האופן שבו ניתן לכמת ייצוא mRNA, אנא עיינו בטקסט המקוון כאן. נקודת הזמן של 120 דקות הוגדלה. כדי להדגים את הקולוקליזציה של mRNA של TFS delta I ברשת האנדופלזמית, מוצג מיזוג (overlay) של mRNA של T UTS delta I בירוק ושל trap alpha באדום. מידע על האופן שבו ניתן לצבוע mRNA באמצעות חלבונים ניתן למצוא בטקסט המקוון.הראינו לכם כעת כיצד למדוד את קינטיקת הייצוא הגרעיני של mRNA באמצעות מיקרו-הזרקה. בעת ביצוע פרוצדורה זו, חשוב לזכור כי מיקרו-הזרקה מוצלחת מחייבת הכנה נאותה. שלבים מרכזיים כגון הכנת דגימות DNA ו-RNA, משיכת מחטים, כיוון ציוד אופטי ופתרון בעיות במיקרו-הזרקה מתוארים בפרוטוקול הכתוב שלנו.בעת הדמיה וניתוח של mRNA שהוזרק במיקרו-הזרקה, חשוב שהכימות יוגבל לתאים שקיבלו יותר מ-90% מהנוזל המוזרק אל הגרעין. ניתן להעריך הצלחה של הזרקה גרעינית על ידי ויזואליזציה של התפלגות organ green dextran בגרעין ובציטופלזמה. אנא עיינו בפרוטוקול המקוון שלנו למידע נוסף על תכנון פרובים לדגים ובשימוש בתוכנה לניתוח תמונות לצורך ניתוח התפלגות ה-mRNA בציטופלזמה ובגרעין.זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.

analysis-mrna-nuclear-export-kinetics-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן אנו מדגימים microinjection cytoplasmic...

Microinjection של ביציות Xenopus Laevis

הזרקה ישירה של intranuclear cDNA היא טכניקה יעילה transfection שלאחר mitotic תאים. שיטה זו מספקת רמות גבוהות של ביטוי חלבון מן Heterologous בונה cDNA בודדות או מרובות ומאפשר תפקוד החלבון להיחקר בסביבה רלוונטית מבחינה פיזיולוגית עם מגוון רחב של מבחני תא בודד.

Microinjection Intranuclear של דנ&quot;א לתוך ניתק נוירונים היונקים למבוגרים

פרוטוקול להכנת חזקים, בקנה מידה קטן תמציות הלה גרעיני מתואר. פרוטוקול זה הוא בעל ערך עבור מבחני הדורשים שימוש של אוכלוסיות קטנות של תאים, כגון תאים שטופלו בתרופות או RNAi. השיטה צריכה להיות ישים למגוון רחב של ביטוי גנים מבחני סוגי תאים אחרים, כולל תאים חולים.

בקנה מידה קטן תמציות גרעיני עבור מבחני פונקציונלית של הגן ביטוי Machineries

בשל גודלם הגדול וארגונם הפשוט יחסית, תאי אחות דרוזופילה מתאימים באופן אידיאלי למחקרי הדמיה של תאים חיים. סרטון זה מתאר שיטת מיקרו-הזרקה להעברת תרכובות אקסוגניות לתוך התאים, והפרוטוקול המוצג מדגים את ההליך עם בדיקות אוליגונוקלאוטיד פלואורסצנטיות הנקראות משואות מולקולריות (MBs) המשמשות להדמיית תעתיקי mRNA אנדוגניים.

מיקרו-הזרקה של תאי אחות דרוזופילה: שיטה להעברה תוך-תאית

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין mRNAs endoplasmic reticulum הקשורים בתאי תרבית רקמת יונקים. טכניקה זו כרוכה permeabilization סלקטיבית של קרום הפלזמה עם digitonin להסיר תוכן cytoplasmic אחרי...

ויזואליזציה של mRNAs לוקליזציה reticulum endoplasmic בתאי יונקים

פרוטוקול זה מתאר שיטה רגיש למדוד את קצב ההעברה nucleocytoplasmic בתוך נוירון כמו NSC-34 תאים תאים על ידי כימות השינוי בזמן אמת ביבוא גרעיני של חלבון NLS-NES-GFP.

Assay למדוד Nucleocytoplasmic התחבורה בזמן אמת בתוך מוטורי נוירון כמו NSC-34 תאים

ביוגנזה של snRNAs של הספנסאוסיס הוא תהליך מורכב הכולל תאים סלולריים שונים. כאן, אנחנו המועסקים מיקרוהזרקה של מתויג באמצעות שוכרים snRNAs כדי לפקח על ההובלה שלהם בתוך התא.

ניתוח של לוקליזציה של הספולקסיזומאואליזציה של האדם בתאי הלה באמצעות מיקרו הזרקה

פיתחנו בדיקת כתב ביוגנזה של מיקרו-רנ"א אינטרוני, שתשמש בתאים במבחנה עם ארבעה פלסמידים: אחד עם miRNA אינטרוני, אחד עם המטרה, אחד כדי לבטא יתר על המידה חלבון רגולטורי, ואחד עבור Renilla luciferase. ה-miRNA עובד ויכול היה לשלוט בביטוי לוציפראז על ידי קשירה לרצף המטרה.

בדיקת כתב לניתוח התבגרות מיקרו-רנ"א אינטרוניים בתאי יונקים

Microinjection היא שיטה מבוססת ויעילה החדרת חומרים זרים לתוך עוברי דג הזברה מופרית. כאן, אנו להפגין טכניקה microinjection חזקים לביצוע overexpression mRNA, ואת הגן morpholino oligonucleotide מציאה מחקרים דג הזברה.

Microinjection של mRNA ו oligonucleotides Morpholino antisense עוברי דג הזברה.

אנו מתארים שיטה לניתוח שינוי של N-linked glycans דרך חיים המוקדם של גליקופרוטאינים לאחר ביוסינתזה שלהם בתאי יונקים. זו מושגת על ידי ניתוח הדופק מרדף של glycans שכותרתו מטבולית, לשחרר האנזימטית של גליקופרוטאינים ובחינה על ידי HPLC.

Pulse-מרדף ניתוח של N-linked שרשראות סוכר מ גליקופרוטאינים בתאי יונקים

למדו כיצד למדוד קינטיקה של ייצוא mRNA גרעיני בתאי יונקים באמצעות מיקרו-הזרקה והכלאה פלואורסצנטית in situ. שיטה זו מאפשרת כימות מדויק של תנועת mRNA מהגרעין לציטופלזמה.

אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

גלה סרטונים נוספים