אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

המטרה הכוללת של הליך זה היא למדוד את הקינטיקה של ייצוא גרעיני mRNA בתאי יונקים. זה מושג על ידי הזרקת מיקרו ראשונה mRNA או DNA לגרעינים של תאי תרבית רקמות יונקים. לאחר מיקרו-הזרקה, הדגימות מקובעות לאחר תקופות דגירה שונות.

לאחר מכן ה-mRNA נצבע על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרה או דגים. השלב האחרון של ההליך הוא הדמיית התאים ולכמת את כמות הקרינה בציטופלזמה ובגרעין. בסופו של דבר, ניתן למדוד את קצב ייצוא ה-mRNA באמצעות שילוב של מיקרו-הזרקה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

היי, אני SRG AV מהמעבדה של אלכס פאלאצו במחלקה לביוכימיה באוניברסיטת טורונטו. אני סטפן טוסקי, גם הוא ממעבדת פאלאצו. אני איימי ממעבדת פאלאצו ואני קי מהא דיוויד ממעבדת פאלאצו.

היום נראה לכם נוהל להחדרת mRNA לגרעיני תאי תרבית רקמות יונקים באמצעות מיקרו-הזרקה. נדגים גם כיצד לצבוע את ה-mRNA על ידי פלואורסצנטי בהכלאה של C two. אנו משתמשים בהליכים אלה במעבדה שלנו כדי לחקור את הקינטיקה של ייצוא גרעיני mRNA בתאי יונקים.

אז בואו נתחיל. לפני המיקרו-הזרקה, DNA פלזמה שהוכן בעבר בין 50 ל-200 מיקרוגרם למיליליטר במאגר הזרקה. הבא באורגון גרין 4 88 או OG מצומד ל-70 קילו-דלטון דקסטרן לתערובת כדי לאפשר זיהוי של תאים מוזרקים.

הדקסטרן המצומד של OG יעזור לקבוע כמה מהנוזל הוזרק לגרעין וכמה דלף לצנטריפוגת הציטופלזמה. הדגימות ב-13,000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות כדי לגלול כל חומר חלקיקי שעלול לחסום את קצה המחט. בחר את קו תאי היונקים להזרקת מיקרו על סמך הקריטריונים המתוארים בעלות הפרוטוקול הכתוב.

שבעה תאים משמשים לזרע הדגמה זה. התאים על כיסוי שטופים בחומצה מחליקים בכלי פטרי של 30 מילימטר לפחות 24 שעות לפני המיקרו-הזרקה. באופן אידיאלי, שכבת התא החד-שכבתית צריכה להיות בערך 70 עד 90% בזמן ההזרקה כדי לאפשר זיהוי קל של התאים המוזרקים, שכבת התא החד-שכבתית נפצעת לפני ההזרקה באמצעות קצה פיפטה מפלסטיק של 200 מיקרוליטר.

חרטו פצע צולב על החלקת הכיסוי והשאירו את התאים להתאושש באינקובטור תרבית הרקמה לפחות 15 דקות לפני ההזרקה. עבור מיקרו-הזרקה, השתמש במיקרוסקופ הפוך המבודד על שולחן אוויר כדי למזער רעידות שעלולות להיות מופרעות לתהליך המיקרו-הזרקה. בעזרת קצה מעמיס ג'ל einor, הסר כמיקרוליטר אחד מהחלק העליון של דגימת הצנטריפוגה כדי למנוע שיבוש הגלולה.

הכנס את קצה הפיפטה לקצה האחורי של מחט מיקרו-הזרקה טרומית והוציא את הנוזל. הנוזל יישאב לקצה המחט על ידי פעולה נימית. מניסקוס ליד הקצה אמור להיות גלוי תוך חמש עד 30 שניות.

הנח את המחט המלאה בנוזל לתוך השרביט והדק אותה למניפולטור המיקרו. בזווית של 45 מעלות, דמיין את המחט באמצעות המטרה 10x ומקם אותה במרכז שדה הצפייה ליד מישור המוקד. באמצעות כפתורי המניפולטור הגסים, השרביט מחובר באמצעות צינור למזרק זכוכית, המשמש ליצירת הלחץ הנדרש להוצאת הנוזל מקצה המחט.

כדי לשמור על לחץ קבוע, המזרק מותקן על מהדק צינור. בעזרת שני פקקי גומי ושני מהדקי מתכת, הרם את המחט כמה מילימטרים כדי למנוע ממנה להינזק בשלבים מאוחרים יותר ולאחר מכן דחף את המיקרוסקופ לאחור. עמוד, הגדל את הלחץ על ידי לחיצה על בוכנת המזרק.

0.5 עד שני סנטימטרים מעוקבים. מניחים צלחת פטרי המכילה חיפוי כיסוי עם שכבה חד-שכבתית פצועה. בשלב הצפייה, משוך את המיקרוסקופ לאחור.

עמוד קדימה למצב זקוף וגורם למעבה להיות מיושר במחט כדי להיכנס לנוזל. יש לעשות זאת בזהירות כדי למנוע מהמחט להישבר על החלקת הכיסוי. באמצעות המטרה 10x, זהה את מרכז הפצע הצולב ומקם את המחט מעל התאים להזרקה.

הגדל את ההגדלה על ידי מעבר למטרה של 40 x. לאחר מכן הורד ומרכז את המחט באמצעות כפתורי הכוונון העדינים בג'ויסטיק. התחל להזריק בפינה אחת של צלב הפצע על ידי הורדת המחט כדי ליצור מגע עם הגרעין.

לאחר ההזרקה, לתא יש שינוי ניכר בבהירות הפאזה. המשיכו לאורך קצה אחד של הצלב הפצוע. לזיהוי קל של תאים מוזרקים במהלך ההדמיה, קריטי שלחץ ההזרקה יותאם כראוי לכל מחט.

הלחץ חייב להיות גבוה מספיק כדי לנקב את הפלזמה ואת הממברנות הגרעיניות, אך לא גבוה עד כדי כך שיהרוג את התאים. מיקרו מזריקים תאים לאורך קצה הפצע לפרק זמן קבוע. בעזרת תרגול ניתן להזריק כמה מאות תאים במרווח זה.

אם הזרקת DNA פלזמה דוגרת על התאים המוזרקים במיקרו ב-37 מעלות צלזיוס בחממת תרבית רקמה למשך 20 דקות לפני הקיבוע, ואז מפסיקים את השעתוק. על ידי טיפול בתאים במיקרוגרם אחד למיליליטר אלפא, מנטין מומס במצע גדילה. ריכוז זה מעכב למעשה שעתוק מפלסמידים מוזרקים מיקרו.

החזר את התאים לאינקובטור ואפשר לתאים לייצא את ה-mRNA החדש שסונתז. ניתן לעשות שימוש חוזר במחט בודדת כדי להזריק מספר פתקי כיסוי. למרות שצריך להחליף את המחט כאשר סוג ה-DNA או ה-RNA המוזרק למיקרו השתנה.

יתר על כן, לאחר הסרת המחט מהשרביט, יש להשליך אותה כדי לקבל מדידה מדויקת של קינטיקה של ייצוא גרעיני mRNA. יש לתקן דגימות נפרדות באפס דקות, 15 דקות, 30 דקות, 60 דקות ו-120 דקות. לאחר טיפול אלפא מאנין בזמן המתאים, יש לשאוב את מצע הגידול ולשטוף את התאים פעמיים בשני מיליליטר של תמיסת PBS.

חשוב לשמור על לחות החלקות הכיסוי על ידי מזעור הזמן שהן לא שקועות בנוזל. תקן את התאים על ידי הוספת שני מיליליטר של 4% אלדהיד ב- PBS דגרו על התאים למשך 15 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפת הדגימות הקבועות פעמיים נוספות, חדירים את התאים עם שני מיליליטר של 0.1% טריטון X 100 ב- PBS, שוב, דוגרים על התאים למשך 15 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.

לבסוף שטפו את הדגימות פעמיים נוספות כדי להכין את הדגימות להכלאה. שטפו את התאים פעמיים עם מאגר כביסה של תמיסת XSSC אחת המכילה 25 עד 60% מהאמצע. לאחר מכן הכינו את תא הצביעה להכלאה על ידי כיסוי החלק התחתון של צלחת פטרי בגודל 150 מילימטר במים והצפת חתיכת פרפורם מעל.

הסר את המים על ידי הפיכת המנה, ובכך אפשר לפרפורם להיצמד לתחתית המנה. הסר ידנית את כל בועות האוויר עבור כל החלקת כיסוי שתוכתם. טיפות של 100 מיקרוליטר מתמיסת ההכלאה על הפרפורם.

שימו לב שיש לייעל את כמות הצורה עבור הדג הספציפי המשמש בעזרת מלקחיים. הסר פתק כיסוי עם התאים הקבועים מצלחת הפטרי בגודל 30 מילימטר. בעזרת נייר סינון ווטמן, יבש את הצד האחורי של החלקת הכיסוי ונתף עודף חיץ מהצד הקדמי מבלי לייבש את התאים.

לאחר מכן הנח את החלקת הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על תמיסת הדגים. חזור על תהליך זה עבור כל החלקת כיסוי. לאחר הנחת מכסה תאי הצביעה בחזרה, דגרו את הדגימות למשך חמש עד 18 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

הכן מספר תאי כביסה באותו אופן שבו הוכן תא הצביעה עבור כל כיסוי החליק פיפטה מיליליטר אחד של מאגר כביסה על הפרפורמה של תא הכביסה. לאחר הדגירה, הסר את החלקות הכיסוי מתא הצביעה על ידי פיפטינג של מיליליטר אחד של מאגר כביסה. ליד פתק הכיסוי, יש לשאוב את הנוזל מתחת לכל דגימה על ידי פעולה נימית.

לאחר מכן הסר את החלקות הכיסוי בעזרת מלקחיים והניח כל אחד על טיפת מאגר כביסה בטמפרטורת החדר המודגרת למשך חמש דקות. שטפו כל החלקה של הכיסוי פעמיים נוספות בסך הכל שלוש כביסות לכל פיפטת החלקה של כיסוי 10 עד 30 מיקרוליטר של תמיסת הרכבה עם dappy על מגלשה שנשטפה בעבר. כל שקופית יכולה להכיל שני פתקי כיסוי באמצעות מלקחיים ונייר סינון ווטמן.

יבש את החלק האחורי של החלקות הכיסוי ונתף עודפי נוזלים מהצד הקדמי של החלקת הכיסוי מבלי לייבש את הדגימות. הנח כל החלקת כיסוי עם הפנים כלפי מטה על טיפת תמיסת הרכבה. ניתן לאחסן דגימות רכובות בארבע מעלות צלזיוס.

כאן ההשפעות של אלפא מנטין על שעתוק של DNA פלזמה מוזרק הראו ל-NIH שלושה תאי פיברובלסטים T, שטופלו מראש בריכוזים משתנים של אלפא מנטין. הוזרקו להם TFL s דלתא i, DNA פלסמיד ו-OG מצומד 70 קילו ודקסטרן. כל שורה מתאימה לשדה ראייה יחיד שצולם עבור OG 70 קילו-דלטון דקסטרן ו-T uts delta I mRNA.

ניכר כי ריכוזים גבוהים של התרופה עיכבו לחלוטין את הייצור של תעתיק T UTS דלתא I, בעוד שהדבר לא נצפה בריכוזים נמוכים יותר. המוצג. הנה מהלך זמן של עלות ייצוא גרעיני mRNA. שבעה תאים הוזרקו עם T UTS delta i plasma DNA ו-OG מצומד 70 קילו-דלטון דקסטרן.

30 דקות לאחר הזרקת התאים טופלו באלפא מנטין והודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך אפס דקות, 60 דקות ו-120 דקות. לאחר מכן התאים תוקנו ונצבעו בבדיקה כנגד T UTS delta I mRNA. ועם נוגדנים כנגד מלכודת הסמן ER אלפא, כל שורה מתאימה לשדה תאים יחיד.

למידע על איך לכמת ייצוא mRNA, אנא עיין בטקסט המקוון כאן. נקודת הזמן של 120 דקות פוצצה כדי להדגים את הקולוקליזציה של TFS delta I mRNA ב-er, מוצגת שכבת-על של ה-T UTS delta I mRNA בירוק והמלכודת אלפא באדום. מידע על איך לצבוע mRNA עם חלבונים ניתן למצוא בטקסט המקוון.

זה עתה הראינו לכם כיצד למדוד את קינטיקה של ייצוא גרעיני של mRNA על ידי מיקרו-הזרקה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור כי מיקרו-הזרקה מוצלחת דורשת הכנה מתאימה. שלבים מרכזיים כגון DNA ו-RNA, הכנת דגימות, משיכת מחטים, יישור ציוד אופטי ופתרון בעיות מיקרו-הזרקה מתוארים בפרוטוקול הכתוב שלנו.

בעת הדמיה וניתוח של mRNA מוזרק מיקרו, חשוב שהכימות יוגבל לתאים שקיבלו יותר מ-90% מהנוזל המוזרק לגרעין. ניתן להעריך הזרקה גרעינית מוצלחת על ידי הדמיית התפלגות הדקסטרן הירוק של האיבר בגרעין ובציטופלזמה. אנא עיין בפרוטוקול המקוון שלנו למידע נוסף על תכנון בדיקות דגים ולשימוש בתוכנת ניתוח תמונה לניתוח התפלגות ה-mRNA בציטופלזמה בגרעין.

אז זהו. תודה על הצפייה ובהצלחה בניסויים שלך.