אנליזה של קינטיקה mRNA גרעיני ייצוא בתאי יונקים ידי Microinjection

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא למדוד את קינטיקת הייצוא הגרעיני של mRNA בתאי יונקים. מטרה זו מושגת תחילה על ידי הזרקה מיקרוסקופית של mRNA או DNA לתוך הגרעינים של תאי תרבית רקמה של יונקים. לאחר ההזרקה המיקרוסקופית, הדגימות מקובעות לאחר פרקי דגירה שונים.

לאחר מכן צובעים את ה-mRNA באמצעות היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (fluorescent in situ hybridization) או fish. השלב הסופי של הפרוצדורה הוא הדמיית התאים וכימות כמות הפלואורסצנציה בציטופלזמה ובגרעין. בסופו של דבר, ניתן למדוד את קצב ייצוא ה-mRNA באמצעות שילוב של מיקרו-הזרקה ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית.

שלום, אני SRG AV מהמעבדה של אלכס פלאזו במחלקה לביוכימיה באוניברסיטה של טורונטו. אני סטפן טוסקי, גם אני ממעבדת פלאזו. אני איימי ממעבדת פלאזו ואני חי מהא דוד ממעבדת פלאזו.

היום נדגים עבורכם פרוצדורה להחדרת mRNA לגרעינים של תאי תרבית רקמה של יונקים באמצעות מיקרו-הזרקה. כמו כן, נדגים כיצד לצבוע את ה-mRNA באמצעות היברידיזציה פלואורסצנטית באתר (FISH). אנו משתמשים בפרוצדורות אלו במעבדה שלנו כדי לחקור את קינטיקת הייצוא הגרעיני של mRNA בתאי יונקים.

אם כן, נתחיל. לפני תאריך ההזרקה המיקרוסקופית, יש לדלל DNA של פלסמידה שהוכן מראש לריכוז שבין 50 ל-200 µg/mL בבופר הזרקה. לאחר מכן, יש להוסיף לתערובת Oregon Green 488 או OG המצומד ל-dextran של 70 kDa כדי לאפשר זיהוי של התאים שהוזרקו.

הדקסטראן המשולב עם OG יעזור לקבוע כמה מהנוזל הוזרק לגרעין וכמה דלף לציטופלזמה. סבבו את הדגימות בצנטריפוגה ב-13,000 G ובטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך 20 דקות לפחות, כדי לשקיע חלקיקים שעלולים לחסום את קצה המחט. בחרו את שורת התאים של היונקים להזרקה מיקרוסקופית בהתאם לקריטריונים המתוארים בפרוטוקול הכתוב.

שבעה תאים משמשים להדגמה זו. התאים מונחים על כיסויות שעברו שטיפה בחומצה בתוך פטריות של 30 מילימטר לפחות 24 שעות לפני ההזרקה המיקרוסקופית. באופן אידיאלי, שכבת התאים צריכה להיות בערך 70 עד 90% confluent במועד ההזרקה כדי לאפשר זיהוי קל של התאים המוזרקים; לפני ההזרקה, יוצרו פצעים בשכבת התאים באמצעות קצה של פיפטה פלסטית בנפח 200 microliter.

חקו חריץ בצורת איקס על לוחית כיסוי (cover slip) והשאירו את התאים להתאושש באינקובטור לתרביות רקמה למשך 15 דקות לפחות לפני ההזרקה. לצורך מיקרו-הזרקה, השתמשו במיקרוסקופ הפוך המבודד על שולחן אוויר כדי למזער רעידות שעלולות להפריע לתהליך המיקרו-הזרקה. באמצעות טיפ למטען ג'ל של einor, הסירו בערך 1 µL מהחלק העליון של דגימת הצנטריפוגה כדי למנוע פגיעה במשקע.

הכנס את חוד הפפיטה לקצה האחורי של מחט מיקרו-הזרקה מוכנה מראש והזרק את הנוזל. הנוזל ייספג אל תוך חוד המחט על ידי פעולת נימיות. מניסקוס סביב החוד אמור להופיע בתוך 5 עד 30 שניות.

הכנס את המחט המלאה בנוזל אל תוך המוט (wand) והדק אותה למיקרו-מניפולטור. בזווית של 45 מעלות, הדמיין את המחט באמצעות עדשה של 10x ומקם אותה במרכז שדה הראייה סמוך למישור המוקד. בעזרת כפתורי הכיוון הגסים של המיקרו-מניפולטור, המוט מחובר באמצעות צינור למזרק זכוכית, המשמש ליצירת הלחץ הדרוש להזרקת הנוזל מקצה המחט.

כדי לשמור על לחץ קבוע, מורכבת המזרקה על תפס צינור. באמצעות שני פקקי גומי ושני תפסים ממתכת, הגביהו את המחט בכמה מילימטרים כדי למנוע את פגיעתה בשלבים מאוחרים יותר, ולאחר מכן החזירו את המיקרוסקופ למקומו. הגביהו את עמוד התמיכה והעלו את הלחץ על ידי לחיצה על בוכנת המזרקה.

0.5 עד שני סמ"ק. הנח פטריה המכילה זכוכית כיסוי עם שכבה אחת פצועה. בבמה התצפיתית, הרחק את המיקרוסקופ לאחור.

הזז את העמוד קדימה למצב זקוף, כך שהקונדנסור יהיה מיושר והמחט תוכל לחדור לנוזל. יש לבצע זאת בזהירות כדי למנוע את שבירת המחט על מכסיות הזכוכית. בעזרת עדשה של 10x, זהה את מרכז הפצע ההצלבי ומיקם את המחט מעל התאים המיועדים להזרקה.

הגדילו את ההגדלה על ידי מעבר לעדשה של 40 x. לאחר מכן, הנמיכו ומקמו במרכז את המחט באמצעות כפתורי הכוונון העדין בידית השליטה. התחילו את ההזרקה באחת מפינות צלב הפצע על ידי הנמקת המחט עד ליצירת מגע עם הגרעין.

לאחר ההזרקה, נראה שינוי בולט בבהירות הפאזה של התא. המשיכו לאורך קצה אחד של הצלב שנוצר מהפגיעה. כדי לאפשר זיהוי קל של התאים המוזרקים במהלך הוויזואליזציה, קריטי להתאים את לחץ ההזרקה כראוי עבור כל מחט.

הלחץ חייב להיות גבוה מספיק כדי לחדור את קרומי הפלזמה והגרעין, אך לא גבוה מדי כדי לא להרוג את התאים. בצעו מיקרו-הזרקה לתאים לאורך שולי הפצע למשך פרק זמן קבוע. עם ניסיון, ניתן להזריק מספר מאות תאים במהלך פרק זמן זה.

אם מזריקים פלסמידי DNA, יש להדגיר את התאים שהוזרקו במיקרו-הזרקה בטמפרטורה של 37 °C באינקובטור לתרביות רקמה למשך 20 דקות לפני הקיבוע, ולאחר מכן להפסיק את השעתוק. זאת על ידי טיפול בתאים ב-1 µg/mL של alpha-amanitin המומס במצע גידול. ריכוז זה מעכב ביעילות שעתוק מפלסמידים שהוזרקו במיקרו-הזרקה.

החזירו את התאים לאינקובטור ואפשרו לתאים לייצא את ה-mRNA שסונתז זה עתה. ניתן להשתמש במחט אחת שוב כדי להזריק למספר זכוכיות כיסוי. עם זאת, יש להחליף את המחט כאשר סוג ה-DNA או ה-RNA המהולל במיקרו-הזרקה משתנה.

בנוסף, ברגע שהמחט מוסרת מהמוט (wand), יש להשליכה כדי להשיג מדידה מדויקת של קינטיקת הייצוא הגרעיני של ה-mRNA. יש לקבע דגימות נפרדות בנקודות זמן של 0 דקות, 15 דקות, 30 דקות, 60 דקות ו-120 דקות. לאחר הטיפול ב-alpha manin בזמן המתאים, יש לשאוב את מצע הגידול ולשטוף את התאים פעמיים בשני מיליליטר של תמיסת PBS.

חשוב לשמור על לוחות הכיסוי לחים על ידי מזעור הזמן שבו הם אינם טבולים בנוזל. קבעו את התאים על ידי הוספת 2 mL של 4% Aldehyde ב-PBS, והדגירו את התאים למשך 15 דקות לפחות בטמפרטורת החדר. לאחר שטיפה נוספת של הדגימות המקובעות פעמיים, בצעו פרמיאביליזציה לתאים באמצעות 2 mL של 0.1% Triton X 100 ב-PBS, ושוב, הדגירו את התאים למשך 15 דקות לפחות בטמפרטורת החדר.

לבסוף, שטפו את הדגימות פעמיים נוספות כדי להכין אותן להיברידיזציה. שטפו את התאים פעמיים עם בופר שטיפה של תמיסת 1X SSC המכילה 25% עד 60% formamide. לאחר מכן, הכינו את תא הצביעה להיברידיזציה על ידי כיסוי תחתיתה של צלחת פטרי בנפח 150 מילימטר במים והצפת פיסת paraform מעליהן.

הסיר את המים על ידי הפיכת הצלחת, ובכך אפשר ל-paraform להיצמד לתחתית הצלחת. הסר ידנית בועות אוויר מכל לביבת זכוכית (cover slip) המיועדת לצביעה. טפטף בעזרת פיפטה טיפות של 100 µl מתמיס ההיברידיזציה על ה-paraform.

שימו לב כי יש לייעל את כמות ה-formage עבור סוג הדג הספציפי שבו משתמשים, וזאת באמצעות פינצטה. הסירו את זכוכית הכיסוי עם התאים המקובעים מתוך פטרי עם קוטר של 30 מילימטר. בעזרת נייר סינון watman, ייבשו את הצד האחורי של זכוכית הכיסוי וספחו את עודפי הבופר מהצד הקדמי מבלי לייבש את התאים.

לאחר מכן, הנח את לוכסנית הכיסוי עם הפנים כלפי מטה על תמיסת הדגים. חזור על תהליך זה עבור כל לוכסנית כיסוי. לאחר החזרת המכסה לתאי הצביעה, דגירה את הדגימות למשך 5 עד 18 שעות ב-37 °C.

הכינו מספר תאי שטיפה באופן דומה לאופן שבו הוכנה תא הצביעה; עבור כל זריקת כיסוי (cover slip), טפטפו באמצעות פיפטה 1 mL של בופר שטיפה על הפרהפורם של תא השטיפה. לאחר הדגירה, הוציאו את זריקות הכיסוי מתאי הצביעה על ידי טפטוף של 1 mL של בופר שטיפה. לצד זריקת הכיסוי, הנוזל אמור להיספג תחת כל דגימה באמצעות פעולת נימיות.

לאחר מכן, הסירו את לביבות הזכוכית (cover slips) בעזרת פינצטה והניחו כל אחת מהן על טיפה של בופר שטיפה שהודגסה בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. שטפו כל לביות זכוכית פעמיים נוספות, לסך הכל שלושה שטיפות לכל לביה. בעזרת פיפט, העבירו 10 עד 30 µL של תמיסת הרכבה עם dappy על גבי סמידה שנשטפה מראש. כל סמידה יכולה להכיל שתי לביות זכוכית, תוך שימוש בפינצטה ובנייר סינון Watman.

ייבשו את גבם של לבישי הכיסוי וספחו נוזלים עודפים מהצד הקדמי של לביש הכיסוי מבלי לייבש את הדגימות. הניחו כל לביש כיסוי עם הפנים כלפי מטה על טיפה של תמיסת קיבוע. ניתן לאחסן דגימות מקובעות בטמפרטורה של ארבעה מעלות Celsius.

כאן מוצגות ההשפעות של alpha mantin על שעתוק של DNA פלסמידי מוזרק בתאי פיברובלסט NIH 3T3, אשר טופלו מראש בריכוזים משתנים של alpha mantin. התאים הוזרקו עם DNA פלסמידי של TFL s delta i ו-OG המשולב עם dextran בגודל 70 kilo. כל שורה תואמת לשדה ראייה בודד שצולם עבור OG 70 kilodalton dextran ו-T uts delta I mRNA.

ניכר כי ריכוזים גבוהים של התרופה עיכבו לחלוטין את ייצור הטרנסקריפט של T UTS delta I, בעוד שדבר זה לא נצפה בריכוזים נמוכים יותר. מוצג כאן מהלך זמן של עלות ייצוא גרעיני של mRNA. שבעה תאים הוזרקו ב-T UTS delta i plasma DNA וב-OG conjugated 70 kilodalton dextran.

30 דקות לאחר ההזרקה, התאים טופלו ב-alpha mantin והודגרו בטמפרטורה של 37 °C למשך אפס דקות, 60 דקות ו-120 דקות. לאחר מכן התאים קובעו ונצבעו באמצעות probe נגד T UTS delta I mRNA, ובנוסף באמצעות נוגדנים נגד סמן ה-ER שנקרא trap alpha. כל שורה תואמת לשדה תאים בודד.

לקבלת מידע על אופן הכימות של ייצוא mRNA, אנא עיינו בטקסט המקוון כאן. נקודת הזמן של 120 דקות הוגדלה. כדי להדגים את הלוקליזציה המשותפת של TFS delta I mRNA ב-er, מוצגת חפיפה של T UTS delta I mRNA בירוק ושל trap alpha באדום. מידע על אופן צביעת mRNA יחד עם חלבונים ניתן למצוא בטקסט המקוון.

הראינו לכם הרגע כיצד למדוד את קינטיקת הייצוא הגרעיני של mRNA באמצעות מיקרו-הזרקה. בעת ביצוע הליך זה, חשוב לזכור שהזרקה מוצלחת דורשת הכנה נאותה. שלבי מפתח כגון הכנת דגימות DNA ו-RNA, משיכת מחטים, כיוון הציוד האופטי ופתרון בעיות במיקרו-הזרקה מתוארים בפרוטוקול הכתוב שלנו.

בעת הדמיה וניתוח של mRNA שהוזרק במיקרו-הזרקה, חשוב שהכימות יוגבל לתאים שקיבלו יותר מ-90% מהנוזל המוזרק אל תוך הגרעין. ניתן להעריך הזרקה גרעינית מוצלחת על ידי ויזואליזציה של התפלגות organ green dextran בגרעין ובציטופלזמה. אנא עיינו בפרוטוקול המקוון שלנו למידע נוסף על תכנון גששים לדגים ועל שימוש בתוכנה לניתוח תמונות לצורך ניתוח התפלגות mRNA בציטופלזמה ובגרעין.

זהו זה. תודה שצפיתם ובהצלחה בניסויים שלכם.