Name: Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-02-04T17:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: למדו שיטת דה-סלולריזציה ורסלולריזציה של כבדים שלמים ליצירת שתלים פונקציונליים. הטכניקה משמרת את המטריצה החוץ-תאית ומאפשרת הכנסת הפטוציטים לשחזור פעילות הכבד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להודות ג&#39;ק Milwid לעיצוב של בתא זלוף חוץ גופית. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מ-NIH בארה&quot;ב, R01DK59766 ו R01DK084053 כדי R00DK080942, שלי KU, בארה&quot;ב NSF CBET-0853569 ל KU ואת שריינרים חולים לילדים BEU (ללא מענק. 8503). אנחנו גם מכירים תמיכה שריינרים חולים לילדים.

1. כבד Decellularization <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר כבד חולדה עם cannulation וריד הפורטל באמצעות ו - 18-מד קטטר. השאירו את נחות מעולה הווריד הנבוב פתוח. שמור את האיבר hydrated ב שנאגרו מלוחים פוספט (PBS) בצלחת פטרי 10 ס"מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מערכת זלוף שמורכבת המאגר 8 ליטר, משאבת peristaltic ואת מלכודת בועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלאו את המערכת זלוף עם פוספט שנאגרו מליחים להשאיר אותו פועל במשך 10 דקות. מלאו PBS לתוך צלחת פטרי 10 ס"מ ולהפחית את קצב הזרימה של פוספט שנאגרו מלוחים 1 מ"ל / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות להעביר את הכבד כדי לקצור פוספט שנאגרו מלוחים מלאים 10 ס"מ צלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך זלוף PBS לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל זלוף עם 0.01% (w / v) dodecyl נתרן גופרתי (SDS) בתוך מים מזוקקים במשך 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse עם PBS שעה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 1.6 ו - 1.7 שלוש פעמים נוספות להגדיל את זמן זלוף SDS עד 10 דקות, 15 ו 20 באותו זמן כל אחד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך זלוף עם 0.01% (w / v) SDS למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך זלוף עם 0.1% (w / v) SDS למשך 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse עם 0.2% (w / v) SDS במשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse עם 0.5% (w / v) SDS במשך 3 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse עם מים מזוקקים במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse עם 1% (w / v) טריטון X-100 במים מזוקקים למשך 30 דקות כדי להסיר כל חומצות גרעין מחויב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשטוף את המטריצה ​​הכבד decellularized (DLM), perfuse עם PBS למשך 2 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: לכרות את כל האונות מלבד האונה חציון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות DLM בצלחת פטרי נקי ואטום ספוגה PBS ב 4 מעלות צלסיוס עד מוכן לשימוש (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעקר את DLM: 1) הורידו את DLM עם סטרילי PBS המכיל 0.1% (V / V) חומצה peracetic ו -4% (v / v) אתנול דגירה במשך 3 שעות ב 4 o C. 2) לשטוף עם סטרילי PBS 2 פעמים. 3) שטפי עם סטרילי PBS המכיל 2% פניצילין, סטרפטומיצין, 10ug / mL גנטמיצין, ו -2.5 UG / mL amphotericin B. חנות הכבד decellularized בתמיסה באותו 4 מעלות צלסיוס עד מוכן לשימוש עבור ניסויים recellularization. </li></ol> 2. Recellularization של Decellularized כבד מטריקס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מערכת זלוף שמורכבת חדר זלוף, משאבת peristaltic ואת מלכודת בועה בתנאים סטריליים. מלאו את המערכת זלוף עם 200 מ"ל של מדיום תרבות, למשל, גלוקוז DMEM גבוהה (Sigma), 10% בסרום שור העובר (Hyclone,), 100 מ"ל U -1 פניצילין, ו -100 מיקרוגרם למ"ל -1 סטרפטומיצין (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המטריצה ​​הכבד decellularized בחדר זלוף ולחבר את DLM למערכת זלוף דרך צינורית את הווריד הפורטל בעוד המשאבה פועלת ב 5 מ"ל / דקה, כדי למנוע היווצרות של כל בועות האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר זלוף של המדיום דרך DLM במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד hepatocytes העיקרי של חולדה בוגרת עם הכדאיות לפחות 90%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עצור את זרימת במערכת זלוף לאט להזריק 50,000,000 hepatocytes (ב 1-3 מ"ל של מדיום תרבות) לתוך המערכת זלוף דרך ללכוד את הבועה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התחל את הזרימה ב 10 mL / min ו recirculate בינוני למשך 10 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלבים 2.5 ו - 2.6 עד סכום של 200 מיליון תאים מוכנסים DLM (איור 2) 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל התאים הם perfused לתוך DLM, לאסוף את perfusate לארבע 50 מ"ל ו - צינורות צנטריפוגה צנטריפוגה בסל"ד 600 במשך 10 דקות. בטל supernatants לאסוף את כדורי לתוך צינור אחד. קבע את מספר התאים ואת הכדאיות באמצעות הרחקה trypan כחול כדי לקבוע את היעילות זריעה. </li></ol> 3. בתרבות חוץ גופית של שתל הכבד Recellularized <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדרת מערכת זלוף שמורכבת חדר זלוף, משאבת oxygenator peristaltic, ואת מלכודת בועה בתנאים סטריליים (איור 3). מלאו את המערכת זלוף עם 50 מ"ל של מדיום תרבות, למשל, וויליאמס E '(Sigma), 5% בסרום שור העובר (Hyclone,), 0.5 מ"ל U אינסולין -1 (Eli Lilly), 20 ננוגרם למ"ל -1 EGF (Invitrogen) , 14 ננוגרם למ"ל גלוקגון -1 (בדפורד Laboratories), 7.5 מיקרוגרם למ"ל -1 הידרוקורטיזון (Pharmacia), 100 מ"ל U -1 פניצילין, ו -100 מיקרוגרם למ"ל -1 סטרפטומיצין (Invitrogen). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את שתל הכבד recellularized בחדר זלוף ולחבר את DLM למערכת זלוף דרך צינורית את הווריד הפורטל בעוד המשאבה פועלת ב 5 מ"ל / דקה, כדי למנוע היווצרות של כל בועות האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסביבה נקייה מחיידקים, לסגור את תא זלוף ולאטום היטב, כדי למנוע כל דליפה במהלך התרבות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת מערכת זלוף אל באינקובטור כי הוא 37 מעלות צלסיוס ויש לו 10% CO 2 ולהגדיל את קצב הזרימה זלוף עד 15 mL / min. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חבר את oxygenator ל 95% O 2 ו - 5% CO 2 מיכל גז תערובת ולהגדיר את קצב זרימת הגז עד 0.5 ליטר / דקה. זה צריך להגיע ללחץ חמצן חלקי של approximately 400 מ"מ כספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות עשוי להמשיך עד 10 ימים עם השינויים היומיים של המדיום לתרבות. בינוני התרבות ניתן שנדגמו יומי לניטור של פונקציות הכבד של השתל כמו אוריאה, אלבומין והפרשת סך חומצות מרה. בסוף התקופה, תרבות, שתל הכבד recellularized ניתן שנדגמו לצורך ניתוח מולקולרית היסטולוגית. </li></ol> 4. נציג תוצאות: Decellularization מלאה של הכבד עכברוש לוקח בערך 72 שעות באמצעות פרוטוקול המתואר. מטריקס שומרת על 100% כתוצאה של סיבי הקולגן, 50% glycosaminoglycans, ורק 5% של ה-DNA של הכבד יליד (טבלה 1) 6. מבנה כלי הדם של מטריצה ​​נשמרת כפי שמעידים קורוזיה הליהוק ניתוח במיקרוסקופ אלקטרונים סורק (איור 4) 6. הנוכחות של ארכיטקטורה בתוך כלי הדם מאפשר DLM ואכלוס שלה עם תאים עם יעילות של 96% ו זלוף הבאים שלה עבור בתרבות חוץ גופית. שתל הכבד recellularized יכול להיות מתורבת עד 10 ימים במבחנה ומציג פונקציות הכבד תקין כפי שאושרו באמצעות אוריאה, אלבומין ו מרה סך הפרשת חומצה (איור 5) 6. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. Decellularized מטריצה ​​כבד בסוף התהליך decellularization. (א) את הכבד שלם (ב) האונה חציון לאחר כריתה. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. ייצוג סכמטי של recellularization של DLM. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. זלוף מערכת ההתקנה בתרבות במבחנה של שתל הכבד recellularized. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. מבנה כלי הדם נשמר במטריצה ​​הכבד decellularized. יצוק תמונות קורוזיה של א) התקינה של הכבד, ב) כבד decellularized vasculature, (כחול) פורטל (אדום) ורידים. סריקת תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים של ג DLM) כלי שיט, ד) קטע ובו צינור המרה כמו כלי קטן (חיצים), ברים סולם (a, b) 5 מ"מ (ג, ד) 20 מיקרומטר. <img src="/files/ftp_upload/2394/2394fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. פונקציות הכבד ספציפיים של שתל הכבד recellularized במהלך בתרבות זלוף חוץ גופית. הפרשה) אלבומין (p = 0.5249), ב) ייצור אוריאה (p = 0.5271) ו - ג) מרה סך הפרשת חומצה (p = 0.0114). ניתוח סטטיסטי של ההבדל בין הניסוי ואת השליטה נעשה במשך 10 ד התרבות על ידי בדיקה של פרידמן בבית = 0.01. ברים שגיאה מייצגים SEM (n = 3). <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> טרי livera </td><td> Decellularized הכבד מטריצה </td><td rowspan="2"> P-ערכים </td><td rowspan="2"> % הכבד טרי </td></tr><tr><td></td><td> n = 4 </td><td> n = 8 </td></tr><tr><td> קולגן </td><td rowspan="2"> 0.07 ± 0.01 </td><td rowspan="2"> 0.08 ± 0.03 </td><td rowspan="2"> 0.56 </td><td rowspan="2"> 114% </td></tr><tr><td> (מ"ג הכבד גרם) </td></tr><tr><td> Glycosaminoglycans </td><td rowspan="2"> 73.1 ± 6.7 </td><td rowspan="2"> 34.2 ± 2.9 </td><td rowspan="2"> 0.004 </td><td rowspan="2"> 47% </td></tr><tr><td> (מ"ג הכבד גרם) </td></tr><tr><td> ה-DNA </td><td rowspan="2"> 14.9 ± 5.6 </td><td rowspan="2"> 0.44 ± 0.08 </td><td rowspan="2"> 3.3 10 -5 </td><td rowspan="2"> 2.9% </td></tr><tr><td> (מ"ג הכבד גרם) </td></tr></tbody></table> טבלה 1. הרכב ביוכימי של מטריקס הכבד decellularized לעומת הכבד הילידים. ערכים מיוצגים ממוצע ± SEM

<ol><li>Kulig, K. M., Vacanti, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatic+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Transpl+Immunol%22%5BJournal%5D)">Hepatic tissue engineering.</a> Transpl Immunol. 12, 303-310 (2004).</li>
<li>Lutolf, M. P., Hubbell, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biomaterials+as+instructive+extracellular+microenvironments+for+morphogenesis+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Synthetic biomaterials as instructive extracellular microenvironments for morphogenesis in tissue engineering.</a> Nature biotechnology. 23, 47-55 (2005).</li>
<li>Dahl, S. L., Koh, J., Prabhakar, V., Niklason, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularized+native+and+engineered+arterial+scaffolds+for+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation.</a> Cell Transplant. 12, 659-666 (2003).</li>
<li>Schechner, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engraftment+of+a+vascularized+human+skin+equivalent%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Engraftment of a vascularized human skin equivalent.</a> FASEB J. 17, 2250-2256 (2003).</li>
<li>Gilbert, T. W., Sellaro, T. L., Badylak, S. F., F, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+of+tissues+and+organs%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Decellularization of tissues and organs.</a> Biomaterials. 27, 3675-3683 (2006).</li>
<li>Uygun, B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organ+reengineering+through+development+of+a+transplantable+recellularized+liver+graft+using+decellularized+liver+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Organ reengineering through development of a transplantable recellularized liver graft using decellularized liver matrix.</a> Nat Med. , (2010).</li>
</ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

Decellularization זלוף השיטה המתוארת כאן מייצר הכבד פיגום שלם בעל מבנה ברוטו אותו ואת ארכיטקטורה כלי הדם של הכבד הילידים. הפיגום בעל הרכב תאי מטריקס דומה הכבד הילידים. השיטה משיגה recellularization Repopulation של הפיגום עם תאים בכל יעילות גבוהה התאים נשארים קיימא תפקודית במהלך התקופה תרבות במבחנה נבדק. עם תוספת של תאים nonparenchymal לתוך שתל הכבד recellularized, אנו צופים כי שתל הכבד recellularized עשויה לשמש כפלטפורמה ללמוד פונקציות הכבד שונים כגון מטבוליזם הת...

A correction was made to <a href="http://www.jove.com/Details.php?ID=2394">Decellularization and Recellularization of Whole Livers</a>. There was an error with an author's name. The author's last name had a typo and was corrected to:
Nima Saeidi
instead of:
Nima Saedi.

Erratum: Decellularization and Recellularization of Whole Livers

<table><tbody><tr><td>סודיום דודציל סולפט</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4390</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>הנעה דיגיטלית Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-07523-80</td><td></td></tr><tr><td>ראש משאבה סטנדרטי Masterflex L/S</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW- 07013-81</td><td></td></tr><tr><td>מלכודת בועות</td><td>Radnoti Glass Technology Inc.</td><td>130149</td><td></td></tr></tbody></table>

decellularization ו recellularization של כבדים שלמים

Decellularization and Recellularization of Whole Livers

הכבד הוא איבר מורכב המחייב זלוף קבוע עבור אספקת חומרי מזון וחמצן וסילוק של פסולת על מנת לשרוד 1. המאמצים לשחזר או לחקות את הכבד עם מיקרו בטענה את הגישה באמצעות הנדסת רקמות וטכניקות microfabrication לא הצליחו עד כה בשל האתגר הזה העיצוב. בנוסף, biomaterials סינתטיים המשמשים ליצור פיגומים רקמת הכבד יישומים הנדסיים היה מוגבל בזירוז התחדשות רקמות ולתקן במידה רבה בשל היעדר מוטיבים תאים ספציפיים מחייב כי תגרום הפונקציות תא תקין 2. רקמות Decellularized יליד כלי דם כגון 3 ו - 4 עור מצד שני מצאו יישומים רבים בתחום הנדסת רקמות, סיפקו פתרון מעשי לחלק האתגרים. היתרון של מטריקס decellularized יליד הוא שהיא שומרת, במידה מסוימת, את ההרכב המקורי, מיקרו, ומכאן שיפור מצורף התא מחדש 5. בעבודה זו אנו מתארים שיטות לבצע זלוף-decellularization של הכבד, כך כבד bioscaffold שלם אשר שומרים על המבנה של כלי הדם הגדולים מתקבל. יתר על כן, אנו מתארים שיטות recellularize אלה bioscaffolds עם hepatocytes העיקרי מבוגר, יצירת שתל הכבד כי הוא פונקציונלי במבחנה, ויש לו גישה לכלי הכרחי עבור השתלת in vivo.

Decellularization זלוף היא שיטה חדשנית לייצור פיגומים כבד כל כך שומרת על הרכב תאי מטריקס של איברים ארכיטקטורה. בזאת, השיטה של ​​הכנת פיגומים איבר שלם באמצעות decellularization זלוף ואכלוס הבאים עם hepatocytes מתואר. שתלי כבד פונקציונליים להשתלה ניתן להפיק באמצעות טכניקה זו.

Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

הכבד הוא איבר מורכב הדורש פרפוזיה מתמדת לצורך אספקת חומרים מזינים וחמצן וסילוק פסולת על מנת לשרוד1. מאמצים ל...

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין שתלי כבד מנורים באמצעות מטריקס של כבד שעבר דה-צלולריזציה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי קניולציה של כבד מתורם. לאחר מכן, האיבר עובר דה-צלולריזציה באמצעות פרפוזיה עם סדרה של תמיסות דטרגנטים.לאחר מכן, ביצוע רבסוולקולריזציה (Revascularization) של מטריצת הכבד שסולקה מהתאים נעשה על ידי הזרקה של הפטוציטים ראשוניים של מבוגרים באמצעות פרפוזיה. לבסוף, נעשה שימוש במערכת פרופוזיה (profusion) in vitro כדי לתרבת את השתל הכבדי המתוחלת. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות תפקוד כבדי של השתלים שגודלם הותאם in vitro, וזאת באמצעות מדידה של הפרשת אלבומין, Urea וחומצות מרה כוללות במדיום הפרופוזיה.היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ייצור פיגומים באמצעות ביו-חומרים סינתטיים וטכניקות מסורתיות להנדסת רקמות, הוא לדעתי נוכחותו של הרכב המטריצה החוץ-תאית הספציפי לרקמה. לפיגום שעבר דה-צלולריזציה בפרפוזיה יש גם את המיקרו-ארכיטקטורה הספציפית לרקמה, כגון המבנה הכלי. נוכחותו של המבנה הכלי מאפשרת לנו להחזיר את התאים אל הפיגום בצורה אחידה יותר.הדבר מאפשר לנו גם לבצע פרפוזיה אחידה של חומרים מזינים כדי לשפר את הישרדות התאים. חלקו של הפרוטוקול העוסק בהאטה יודגם על ידי נימה יחד עם עמית הפוסט-דוקטורט במעבדה שלנו. החלק העוסק ב-re retailization יודגם על ידי גבריאל פריס, שגם הוא עמית פוסט-דוקטורט.עבודתה מתמקדת בתיעוש של השתלות אלו. כדי לבצע דסלולריזציה בפרפוזיה, התחילו בהוצאת כבד של חולדה באמצעות קנולציה של הווריד השער (portal vein). באמצעות קטטר במידה 18, השאירו את הווריד הרCava התחתון והעליון פתוחים. שמרו על האיבר הידרטנבי בתמיסת סলাইন עם בופר פוספט או PBS בצלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים.בשלב הבא, הגדירו מערכת פרפוזיה המורכבת ממאגר של שמונה ליטרים, משאבה פריסטלטית ומלכודת בועות. מלאו את מערכת הפרפוזיה במי מלח עם בופר פוספטים או PBS והפעילו אותה למשך 10 דקות. לאחר מכן, מלאו צלחת פטרי של 10 סנטימטרים ב-PBS והפחיתו את קצב זרימת הבופר ל-1.2 milliliters per minute.העבר בזהירות את הכבד שנאסף אל צלחת פטרי עם PBS והשאר אותו להפזורה למשך הלילה. למחרת, בצע פרפוזיה לכבד עם 0.01% sodium ESAL sulfate או SDS במים מזוקקים למשך חמש דקות.לאחר מכן, העבירו שוב ל-PBS למשך שעה אחת. חזרו על שלבי הפרופוזיה עם SDS ו-PBS שלוש פעמים נוספות, תוך הגדלת זמן הפרופוזיה של SDS ל-10, 15 ולבסוף 20 דקות. לאחר מכן, בצעו פרופוזיה לכבד עם הסדרה הבאה: 0.01%SDS למשך 24 שעות.0.1%SDS למשך 24 שעות. 0.2%SDS למשך שלוש שעות, 0.5%SDS למשך שלוש שעות. מים מזוקקים למשך 15 דקות, 1%Triton X 100 במים מזוקקים למשך 30 דקות, דבר שיסיר חומצות גרעיניות קשורות.ולבסוף, PBS למשך שעתיים, אשר ישטוף את מטריקס הכבד לאחר הסרת התאים (DLM) לאחר השלמת הפרפוזיה במידה ורצוי; השהרו את כל האונות למעט האונה המדיאלית. אחסנו את ה-DLM בצלחת פטרי נקייה ואטומה ב-PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. כדי לעקם את ה-DLM, שטפו אותו ב-PBS סטרילי המכיל 0.1%per acetic acid ו-4%ethanol והדגרו אותו למשך שלוש שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.בשלב הבא, שטפו את ה-DLM עם PBS סטרילי פעמיים. לאחר מכן, שטפו עם PBS המכיל 2% penicillin streptomycin בריכוז 10 micrograms per milliliter, gentamycin ו-2.5 micrograms per milliliter Amphotericin B. שמרו את הכבד שעבר דסלולריזציה באותו תמיסה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד למועד השימוש בניסויי ה-ization.שנית, ביצוע תאביליזציה (cellularization) של מטריצת כבד שהוסרו ממנה התאים (decellularized liver matrix) תחת מנדף לתרבית רקמות. התחילו עם מערכת פרפוזיה דומה לזו ששימשה להסרת התאים מהכבד. מלאו את מערכת הפרפוזיה ב-200 milliliters של מצע תרבית, כגון DMEM עם ריכוז גלוקוז גבוה, 10% fetal bovine serum, 100 units per milliliter פניסלין, ו-100 micrograms per milliliter סטריפטומייצין.הנח את ה-DLM לתא הפרפוזיה וחברו למערכת הפרפוזיה באמצעות קנולה לווריד הפורטלי בזמן שהמשאבה פועלת בקצב של five milliliters per minute. כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר, אפשרו למצע לבצע פרפוזיה ל-DLM במשך 30 דקות. לאחר מכן, הפסיקו את הזרימה במערכת הפרפוזיה והזריקו לאט למערכת הפרפוזיה, דרך מלכוד בועות, 50 מיליון הפטוציטים שבודדו מחולדה בוגרת.הפעל מחדש את הזרימה בקצב של 10 milliliters per minute והזרם את המצע במעגל סגור למשך 10 דקות. עצור שוב את זרימת המצע. הזרק 50 מיליון hepatocytes נוספים.לאחר מכן, הפעל מחדש את הזרימה בקצב של 10 milliliters לדקה. חזור על הליך זה עד להחדרה של סך כולל של 200 מיליון hepatocytes ל-DLM. ברגע שכל התאים הוזרקו ל-DLM, אסוף את השאיבה השופעת למבחנות צנטריפוגה בנפח 50 milliliter, וסבב בצנטריפוגה במהירות של 800 RPM למשך חמש דקות.שפכו את העל-נוזלים (supernatants) ואחדו את המשקעים (pellets) לשפופרת אחת. קבעו את מספר התאים ואת חיוניותם באמצעות דחיית תריאן כחול (trypan blue). זאת כדי לקבוע את יעילות הזריעה לתרבית.הכנת גרפט כבד דה-צלולרי. הגדירו מערכת פרפוזיה סטרילית הכוללת מחמצן. מלאו את מערכת הפרפוזיה ב-50 milliliters של תוצר תרבית כגון Williams E עם 5%PBS, ו-0.5 units per milliliter של אינסולין.20 nanograms per milliliter של EGF, 14 nanograms per milliliter של גלוקגון, 7.5 micrograms per milliliter של הידרוקורטיזון, 100 units per milliliter של פניצילין ו-100 micrograms per milliliter של סטרפטומייצין. העבירו את השתל הכבדי המולט בתוך תא הפרפוזיה וחברו אותו למערכת הפרפוזיה באמצעות קנולה בווריד השער, כאשר המשאבה פועלת בקצב של five milliliters per minute.כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר, סגרו את תא הפרפוזיה באופן אספטי ואטמו אותו היטב כדי למנוע דליפות במהלך הגידול. דגרו את מערכת הפרפוזיה בטמפרטורה של 37 °C עם 10% CO2 והגדילו את קצב זרימת הפרפוזיה ל-15 mL/min. חברו את המעשיר (oxygenator) למכל תערובת גזים של 95% O2 ו-5% CO2, וקבעו את קצב זרימת הגז ל-0.5 L/min.פעולה זו אמורה להביא ללחץ חלקי של חמצן של כ-400 millimeters of mercury. המשיכו את התרבית למשך עד 10 ימים, עם החלפה יומית של מצע התרבית. דגמו את המצע מדי יום לצורך בדיקת הפרשת albumin, urea וחומצות מרה כוללות (total bile acid) כדי לנטר את תפקודי הכבד של השתלה בסיום תקופת התרבית.דגמו את השתל הכבדי שעבר תא-הקמשה (cellularize) לצורך אנליזה מולקולרית והיסטולוגית. דה-צלולריזציה (decellularization) מלאה של כבד חולדה אורכת כ-72 שעות, תוך שימוש בפרוטוקול המתואר.המטריצה המתקבלת שומרת על 100% מהקולגן הפיברילי, 50% מהגליקו-אמינו-גליקנים, ורק 5% מה-DNA של הכבד הטבעי. המבנה הווסקולרי של המטריצה נשמר, כפי שעולה מניתוח של יציקת קורוזיה ומיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת. נוכחות המיקרו-ארכיטקטורה הווסקולרית בתוך ה-DLM מקלה על יישובו מחדש בתאים ביעילות של 96% ועל הפרפוזיה שלאחריו.עבור תרבית in vitro, ניתן לתרבת את השתל הכבדי עד 10 ימים in vitro, והוא מראה תפקודי כבד תקינים כפי שאושרו באמצעות הפרשת albumin, urea וחומצות מרה כוללות. לכן, לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לבצע דסלולריזציה ורסלולריזציה של כבד שלם.

decellularization-and-recellularization-of-whole-livers

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

המחקר בתאי הכבד סינוסי אנדותל (שניות) חייב להתבצע עם תאים ראשוניים שהתקבלו החיה לא כמו שורות תאים קיימות. שיטה זו מסתמכת על מערכת העיכול הכבד צנטריפוגה ההפרש לטיהור SEC עבור culturing ניסויים עתידיים.

ב אנדוציטוזה כבד vivo ואחריו טיהור בתאי הכבד על ידי זלוף כבד

שיטת מהירות לחלוטין להסיר רכיבים סלולריים מלב חזירי שלם באמצעות זלוף המדרדר מתוארת. שיטה זו מניבה מטריצת אתר פיגום תאי לבבי ספציפי שבו יש פוטנציאל לשימוש ביישומים קליניים מרובים.

נוהל Decellularization של לב חזירי ידי זלוף כלילית המדרדר

המאמר מתאר מתודולוגיה לייצור מטריצת acellular ממעי חולדה. הגזירה של פיגומי מעיים חשובה ליישומים עתידיים בתחום הנדסת רקמות, ביולוגיה של תאי גזע ובדיקות סמים.

Decellularization מתודולוגיה לייצור של המעיים מטריקס הטבעי acellular

דה-סלולריזציה של איברים שלמים מייצרת פיגומים ביולוגיים טבעיים שעשויים לשמש לרפואה רגנרטיבית. מוצג תיאור של מודל פרימטים לא אנושי של התחדשות ריאות שבו ריאות שלמות עוברות דה-סלולריזציה ולאחר מכן נזרעות עם תאי גזע בוגרים ותאי אנדותל בביו-ריאקטור המאפשר זרימת כלי דם ואוורור מדיה נוזלית.

דה-סלולריזציה של ריאות פרימטים לא אנושיים ורסלולריזציה באמצעות ביו-ריאקטור מיוחד לאיברים גדולים

הטכניקות המוצגות לקצירת כבד, קנולציה וזלוף באמצעות המכשיר הקנייני שלנו מאפשרות מערכי זלוף מתוחכמים לשיפור ניסויי דה-סלולריזציה ורה-סלולריזציה בכבד של חולדות.

נוהל Decellularization של כבדי עכברוש בהתקן זלוף נדנוד לחץ

פרוטוקול זה מתאר דה-סלולריזציה של כליות חולדות Sprague Dawley על ידי זלוף קדמי של חומרי ניקוי דרך כלי הדם, ויוצר מטריצות חוץ-תאיות של כליות המשמשות כתבניות לאכלוס מחדש עם תאי אפיתל כליה אנושיים. רסלולריזציה ושימוש בבדיקת זלוף רזזורין לניטור הצמיחה מבוצעים בתוך ביו-ריאקטורים זלוף שתוכננו במיוחד.

Repopulation תאי אפיתל והכנה של מכרסמים תאיים מטריקס פיגומים לפיתוח רקמות כליה

המטריצה החוץ-תאית של כבד חולדה נטול תאים יכולה לשמש כמודל ex vivo תלת מימדי אנושי כדי לחקור את התפוצה והביטוי הטרנסגני של נגיף או וקטור ויראלי.

לחקר ויראלי וקטורים בתוך אוכלס מחדש תלת מימדי הכבד דגם עם הקו Cell Carcinoma Hepatocellular האדם HepG2

כאן, אנו מתארים את פרוטוקול להצפנה decellularization וריד saphenous באמצעות חומרי ניקוי, recellularization על ידי זלוף של הדם ההיקפיים, המדיום אנדותל.

Decellularization ומתודולוגיה Recellularization עבור האדם הורידים saphenous גדולות

אנו להקים טכניקה כירורגית חדשניים עבור מודל זלוף יחיד בכבד באונה ויוו בשנת החולדה כתנאי נוספת ללמוד ויוו הכבד חלקית הנדסה בעתיד.

טכניקה כירורגית הרומן כבסיס In Vivo חלקי הכבד הנדסה בעכברוש

שיטה זו מאפשרת decellularization של איבר מוצק מורכבים באמצעות פרוטוקול פשוט המבוסס על שוק אוסמוטי זלוף של יונית סבון עם הפרעה מטריצות איבר מינימלי. היא כוללת טכניקה decellularization הרומן מלב אנוש בתוך נרתיק מווסת עם ניטור בזמן אמת זרימה dynamics וסלולר יצוא פסולת.

Decellularization של הלב האנושי כולו בתוך נרתיק מווסת בכיוון הפוך

פרוטוקול זה נועד לבטל את הלב והריאות של עכברים. ניתן לחסן ולדמות את הפיגומים החוץ-תאיים (ECM) המתקבלים כדי למפות את המיקום והטופולוגיה של הרכיבים שלהם.

דקלולריזציה של קומפלקס הקרדיו-ריאות מורין

למדו שיטת דה-סלולריזציה ורסלולריזציה של כבדים שלמים ליצירת שתלים פונקציונליים. הטכניקה משמרת את המטריצה החוץ-תאית ומאפשרת הכנסת הפטוציטים לשחזור פעילות הכבד.

Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

גלה סרטונים נוספים