Decellularization ו Recellularization של כבדים שלמים

המטרה הכללית של פרוצדורה זו היא להכין שתלי כבד מנורים באמצעות מטריקס של כבד שעבר דה-צלולריזציה. מטרה זו מושגת תחילה על ידי קניולציה של כבד מתורם. לאחר מכן, האיבר עובר דה-צלולריזציה באמצעות פרפוזיה עם סדרה של תמיסות דטרגנטים.

לאחר מכן, ביצוע רבסוולקולריזציה (Revascularization) של מטריצת הכבד שסולקה מהתאים נעשה על ידי הזרקה של הפטוציטים ראשוניים של מבוגרים באמצעות פרפוזיה. לבסוף, נעשה שימוש במערכת פרופוזיה (profusion) in vitro כדי לתרבת את השתל הכבדי המתוחלת. בסופו של דבר, ניתן להפיק תוצאות המראות תפקוד כבדי של השתלים שגודלם הותאם in vitro, וזאת באמצעות מדידה של הפרשת אלבומין, Urea וחומצות מרה כוללות במדיום הפרופוזיה.

היתרון המרכזי של טכניקה זו על פני שיטות קיימות, כגון ייצור פיגומים באמצעות ביו-חומרים סינתטיים וטכניקות מסורתיות להנדסת רקמות, הוא לדעתי נוכחותו של הרכב המטריצה החוץ-תאית הספציפי לרקמה. לפיגום שעבר דה-צלולריזציה בפרפוזיה יש גם את המיקרו-ארכיטקטורה הספציפית לרקמה, כגון המבנה הכלי. נוכחותו של המבנה הכלי מאפשרת לנו להחזיר את התאים אל הפיגום בצורה אחידה יותר.

הדבר מאפשר לנו גם לבצע פרפוזיה אחידה של חומרים מזינים כדי לשפר את הישרדות התאים. חלקו של הפרוטוקול העוסק בהאטה יודגם על ידי נימה יחד עם עמית הפוסט-דוקטורט במעבדה שלנו. החלק העוסק ב-re retailization יודגם על ידי גבריאל פריס, שגם הוא עמית פוסט-דוקטורט.

עבודתה מתמקדת בתיעוש של השתלות אלו. כדי לבצע דסלולריזציה בפרפוזיה, התחילו בהוצאת כבד של חולדה באמצעות קנולציה של הווריד השער (portal vein). באמצעות קטטר במידה 18, השאירו את הווריד הרCava התחתון והעליון פתוחים. שמרו על האיבר הידרטנבי בתמיסת סলাইন עם בופר פוספט או PBS בצלחת פטרי בקוטר 10 סנטימטרים.

בשלב הבא, הגדירו מערכת פרפוזיה המורכבת ממאגר של שמונה ליטרים, משאבה פריסטלטית ומלכודת בועות. מלאו את מערכת הפרפוזיה במי מלח עם בופר פוספטים או PBS והפעילו אותה למשך 10 דקות. לאחר מכן, מלאו צלחת פטרי של 10 סנטימטרים ב-PBS והפחיתו את קצב זרימת הבופר ל-1.2 milliliters per minute.

העבר בזהירות את הכבד שנאסף אל צלחת פטרי עם PBS והשאר אותו להפזורה למשך הלילה. למחרת, בצע פרפוזיה לכבד עם 0.01% sodium ESAL sulfate או SDS במים מזוקקים למשך חמש דקות.

לאחר מכן, העבירו שוב ל-PBS למשך שעה אחת. חזרו על שלבי הפרופוזיה עם SDS ו-PBS שלוש פעמים נוספות, תוך הגדלת זמן הפרופוזיה של SDS ל-10, 15 ולבסוף 20 דקות. לאחר מכן, בצעו פרופוזיה לכבד עם הסדרה הבאה: 0.01%SDS למשך 24 שעות.

0.1%SDS למשך 24 שעות. 0.2%SDS למשך שלוש שעות, 0.5%SDS למשך שלוש שעות. מים מזוקקים למשך 15 דקות, 1%Triton X 100 במים מזוקקים למשך 30 דקות, דבר שיסיר חומצות גרעיניות קשורות.

ולבסוף, PBS למשך שעתיים, אשר ישטוף את מטריקס הכבד לאחר הסרת התאים (DLM) לאחר השלמת הפרפוזיה במידה ורצוי; השהרו את כל האונות למעט האונה המדיאלית. אחסנו את ה-DLM בצלחת פטרי נקייה ואטומה ב-PBS בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס עד למועד השימוש. כדי לעקם את ה-DLM, שטפו אותו ב-PBS סטרילי המכיל 0.1%per acetic acid ו-4%ethanol והדגרו אותו למשך שלוש שעות בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס.

בשלב הבא, שטפו את ה-DLM עם PBS סטרילי פעמיים. לאחר מכן, שטפו עם PBS המכיל 2% penicillin streptomycin בריכוז 10 micrograms per milliliter, gentamycin ו-2.5 micrograms per milliliter Amphotericin B. שמרו את הכבד שעבר דסלולריזציה באותו תמיסה בטמפרטורה של ארבעה מעלות צלזיוס עד למועד השימוש בניסויי ה-ization.

שנית, ביצוע תאביליזציה (cellularization) של מטריצת כבד שהוסרו ממנה התאים (decellularized liver matrix) תחת מנדף לתרבית רקמות. התחילו עם מערכת פרפוזיה דומה לזו ששימשה להסרת התאים מהכבד. מלאו את מערכת הפרפוזיה ב-200 milliliters של מצע תרבית, כגון DMEM עם ריכוז גלוקוז גבוה, 10% fetal bovine serum, 100 units per milliliter פניסלין, ו-100 micrograms per milliliter סטריפטומייצין.

הנח את ה-DLM לתא הפרפוזיה וחברו למערכת הפרפוזיה באמצעות קנולה לווריד הפורטלי בזמן שהמשאבה פועלת בקצב של five milliliters per minute. כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר, אפשרו למצע לבצע פרפוזיה ל-DLM במשך 30 דקות. לאחר מכן, הפסיקו את הזרימה במערכת הפרפוזיה והזריקו לאט למערכת הפרפוזיה, דרך מלכוד בועות, 50 מיליון הפטוציטים שבודדו מחולדה בוגרת.

הפעל מחדש את הזרימה בקצב של 10 milliliters per minute והזרם את המצע במעגל סגור למשך 10 דקות. עצור שוב את זרימת המצע. הזרק 50 מיליון hepatocytes נוספים.

לאחר מכן, הפעל מחדש את הזרימה בקצב של 10 milliliters לדקה. חזור על הליך זה עד להחדרה של סך כולל של 200 מיליון hepatocytes ל-DLM. ברגע שכל התאים הוזרקו ל-DLM, אסוף את השאיבה השופעת למבחנות צנטריפוגה בנפח 50 milliliter, וסבב בצנטריפוגה במהירות של 800 RPM למשך חמש דקות.

שפכו את העל-נוזלים (supernatants) ואחדו את המשקעים (pellets) לשפופרת אחת. קבעו את מספר התאים ואת חיוניותם באמצעות דחיית תריאן כחול (trypan blue). זאת כדי לקבוע את יעילות הזריעה לתרבית.

הכנת גרפט כבד דה-צלולרי. הגדירו מערכת פרפוזיה סטרילית הכוללת מחמצן. מלאו את מערכת הפרפוזיה ב-50 milliliters של תוצר תרבית כגון Williams E עם 5%PBS, ו-0.5 units per milliliter של אינסולין.

20 nanograms per milliliter של EGF, 14 nanograms per milliliter של גלוקגון, 7.5 micrograms per milliliter של הידרוקורטיזון, 100 units per milliliter של פניצילין ו-100 micrograms per milliliter של סטרפטומייצין. העבירו את השתל הכבדי המולט בתוך תא הפרפוזיה וחברו אותו למערכת הפרפוזיה באמצעות קנולה בווריד השער, כאשר המשאבה פועלת בקצב של five milliliters per minute.

כדי למנוע היווצרות של בועות אוויר, סגרו את תא הפרפוזיה באופן אספטי ואטמו אותו היטב כדי למנוע דליפות במהלך הגידול. דגרו את מערכת הפרפוזיה בטמפרטורה של 37 °C עם 10% CO2 והגדילו את קצב זרימת הפרפוזיה ל-15 mL/min. חברו את המעשיר (oxygenator) למכל תערובת גזים של 95% O2 ו-5% CO2, וקבעו את קצב זרימת הגז ל-0.5 L/min.

פעולה זו אמורה להביא ללחץ חלקי של חמצן של כ-400 millimeters of mercury. המשיכו את התרבית למשך עד 10 ימים, עם החלפה יומית של מצע התרבית. דגמו את המצע מדי יום לצורך בדיקת הפרשת albumin, urea וחומצות מרה כוללות (total bile acid) כדי לנטר את תפקודי הכבד של השתלה בסיום תקופת התרבית.

דגמו את השתל הכבדי שעבר תא-הקמשה (cellularize) לצורך אנליזה מולקולרית והיסטולוגית. דה-צלולריזציה (decellularization) מלאה של כבד חולדה אורכת כ-72 שעות, תוך שימוש בפרוטוקול המתואר.

המטריצה המתקבלת שומרת על 100% מהקולגן הפיברילי, 50% מהגליקו-אמינו-גליקנים, ורק 5% מה-DNA של הכבד הטבעי. המבנה הווסקולרי של המטריצה נשמר, כפי שעולה מניתוח של יציקת קורוזיה ומיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת. נוכחות המיקרו-ארכיטקטורה הווסקולרית בתוך ה-DLM מקלה על יישובו מחדש בתאים ביעילות של 96% ועל הפרפוזיה שלאחריו.

עבור תרבית in vitro, ניתן לתרבת את השתל הכבדי עד 10 ימים in vitro, והוא מראה תפקודי כבד תקינים כפי שאושרו באמצעות הפרשת albumin, urea וחומצות מרה כוללות. לכן, לאחר צפייה בסרטון זה, תהיה לכם הבנה טובה של האופן שבו ניתן לבצע דסלולריזציה ורסלולריזציה של כבד שלם.