בדיקה לכימות פוליפוספט אנאורגני בחיידקים

פוליפוספט אנאורגני (polyP) הוא פולימר פוספט ליניארי המעורב באלימות חיידקית ותגובת עקה, המאוחסן כגרגירים ציטופלזמיים.

כדי לכמת polyP, קח צלחת מרובת בארות עם ריכוזים הולכים וגדלים של תקני פוספט אנאורגני.

הוסף תמצית פולי P חיידקית מטוהרת לבאר ריקה.

הכניסו מאגר תגובה המכיל אנזים אקסופוליפוספטאז לכל באר ודגרו.

האנזים מבקע את polyP לפוספט אנאורגני חופשי, וממיר אותו לצורה הניתנת לכימות.

הוסף מגיב זיהוי המכיל מוליבדט וחומצה אסקורבית ודגירה.

מוליבדט מגיב עם פוספט ליצירת קומפלקסים של פוספומוליבדט, אשר מופחתים על ידי חומצה אסקורבית לקומפלקסים בצבע כחול.

מדוד את הספיגה של המתחם הצבעוני. הספיגה הנמדדת תואמת את עוצמת הצבע הכחול העומדת ביחס ישר לריכוז הפוספט.

צור את העקומה הסטנדרטית וחשב את רמות הפוספט של הדגימה, המשקפת את תכולת ה-polyP המקורית של החיידקים.

התחל בהכנת תקנים המכילים אפס, חמש, 50 או 200 אשלגן פוספט מיקרו-מולרי ב-50 מילי-מולרי pH שמונה טריס-הידרוכלוריד.

יש למנות 100 מיקרוליטר מכל תקן פוספט ו-100 מיקרוליטר של דגימות פוליP שחולצו לבארות נפרדות של צלחת שקופה של 96 בארות. הכן תערובת מאסטר המכילה, לכל דגימה, 30 מיקרוליטר של מאגר תגובה 5X ScPPX, 19 מיקרוליטר מים ומיקרוליטר אחד של ScPPX מטוהר. הוסף 50 מיקרוליטר מתערובת המאסטר לכל באר של צלחת 96 הבארות.

ודוגרים במשך 15 דקות בחום של 37 מעלות צלזיוס. ביום הגילוי, הכינו מלאי עבודה טרי של תמיסת גילוי על ידי ערבוב ב-9.12 מיליליטר של בסיס תמיסת זיהוי עם 88 מיליליטר של חומצה אסקורבית מולרית אחת, ואפשרו לה להגיע לטמפרטורת החדר לפני השימוש. הוסף 50 מיקרוליטר של תמיסת זיהוי לכל דגימה ותקנים בצלחת 96 הבארות.

כדי לאפשר התפתחות צבע, דגרו את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך כשתי דקות. השתמש בקורא צלחות כדי למדוד ספיגה ב-882 ננומטר ולחשב את ריכוז הפוספט של כל דגימה בהשוואה לעקומת תקן אשלגן פוספט. לאחר מכן המירו את ריכוזי הפוספט לננומול של פוספט שמקורו בפוליP בכל ליזאט תא ונרמלו את תכולת הפוליפ התאית לחלבון התאי הכולל, כמתואר בכתב היד.