אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:30 דק׳ • August 29th, 2025
קחו ליזאט של תא חיידקי המכיל רכיבים תאיים, כולל sRNA מתויג MS2 הקשור ל-RNA המטרה שלו.
sRNA מתויג MS2 הוא RNA רגולטורי קטן מהונדס הנושא לולאת גזע אפטמר MS2 בקצה 5′ שלו, המציג זיקה גבוהה לחלבון המעטפת הנגיפי MS2.
העבר את הליזט החיידקי לעמודת כרומטוגרפיה של זיקה מאוזנת מראש המכילה שרף עמילוז הקשור לחלבוני היתוך המורכבים מחלבון קושר מלטוז (MBP) וחלבון המעטפת MS2.
חלבון המעיל המשותק MS2 לוכד באופן ספציפי את לולאת גזע האפטמר של ה-sRNA המתויג MS2, ושומר על ה-sRNA הקשור ל-RNA המטרה השלם.
מולקולות לא מתויגות שנשארות לא קשורות נאספות בזרימה.
שטפו את העמוד עם מאגר כדי להסיר שאריות מולקולות לא קשורות.
עם מאגר המכיל מלטוז, המעביר MBP מהשרף, ומשחרר את ה-sRNA המתויג MS2 הקשור ל-RNA היעד שלו.
אסוף ואחסן את השברים על קרח כדי לשמור על שלמות ה-RNA לניתוח במורד הזרם.
הסר את קצה העמוד, ואז הניח עמוד כרומטוגרפיה במתלה עמודים ושטוף את העמוד במים טהורים במיוחד. הוסף 300 מיקרוליטר שרף עמילוז ושטוף את העמוד עם 10 מיליליטר מאגר A.מדלל 1, 200 פיקמולים של חלבון MBP-MS2 בשישה מיליליטר של מאגר A ומעמיס אותו לעמודה.
שטפו את העמוד עם 10 מיליליטר חיץ A.לאחר מכן, בצע טיהור זיקה MS2. טען את ליזאט התא לתוך העמודה ואסוף את שבר הזרימה בצינור איסוף נקי. שטפו את העמודה שלוש פעמים עם 10 מיליליטר מאגר A ואספו את שבר הכביסה, ואז השליכו את העמודה עם מיליליטר אחד של מאגר E ואספו את שבר הפליטה במיקרו-צינור של שני מיליליטר.
שמור את כל השברים שנאספו על קרח עד למיצוי RNA.