הדמיה בתיווך ננו-חלקיקים של שיפוץ אנדו-ליזוזומלי בתאים נגועים בחיידקים

קח שקופית תא המכילה תאי אפיתל אנושיים עם אנדוזומים עם תווית פלואורסצנטית.

הכניסו חיידקים פתוגניים תוך תאיים ודגרו, ואפשרו להם להיצמד לתאים.

החיידקים מזריקים חלבונים שמארגנים מחדש את השלד הציטולוגי המארח, ויוצרים בליטות ממברנה שמפנימות את החיידקים לוואקולים.

ואקואולים אלה מרחיבים הקרנות צינוריות המתחברות למערכת האנדו-ליזוזומלית, רשת של שלפוחיות ואברונים המווסתים את הסחר התוך-תאי.

הקרנות אלו מכוונות מחדש את הובלת השלפוחית ומעצבות מחדש את המערכת האנדו-ליזוזומלית.

שטפו כדי להסיר חיידקים חוץ-תאיים, ולאחר מכן דגרו עם מדיום המכיל אנטיביוטיקה כדי לחסל את כל החיידקים שנותרו.

החלף במדיום הדמיה נטול סרום המכיל את האנטיביוטיקה, והוסף ננו-חלקיקים המסומנים בפלואורופור מנוגד.

דגירה כדי לאפשר כניסת ננו-חלקיקים באמצעות אנדוציטוזיס והצטברות בשלפוחיות המחודשות.

שטפו כדי להסיר ננו-חלקיקים לא מופנמים, ולאחר מכן דגרו במדיום הדמיה בתוספת סרום.

הננו-חלקיקים הפלואורסצנטיים והאנדוזומים המסומנים מאפשרים הדמיה של העיצוב האנדו-ליזוזומלי המושרה על ידי חיידקים.

כדי להתחיל בהליך זה, יש למדוד את ה-OD 600 של החיידקים התת-מתורבתים ולדלל ל-OD 600 של 0.2 במיליליטר אחד של PBS, להוסיף כמויות מתאימות של חיידקים לתאי HeLa בשקופית תא 8 הבאר כדי להשיג ריבוי זיהום של 100. דגירה למשך 30 דקות בחממת התאים.

שטפו את תאי הלה שלוש פעמים עם PBS כדי להסיר חיידקים לא מופנמים. נקודת זמן זו מוגדרת כשעת אפס לאחר ההדבקה או שעת אפס p.i. מוסיפים לתאים 300 מיקרוליטר של מדיום תרבית טרי המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין ושומרים למשך שעה.

לאחר שעה, החלף את המדיום במדיום הדמיה המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר גנטמיצין. הוסף NPs זהב-BSA-רודמין לתאי HeLa כדי לקבל ריכוז סופי של OD 520 של 0.1.

דגירה למשך שעה. לאחר שעה יש להסיר את המדיום ולשטוף שלוש פעמים עם PBS. לבסוף, הוסף 300 מיקרוליטר של מדיום הדמיה טרי המכיל 10 אחוז FCS ו-10 מיקרוגרם למיליליטר של גנטמיצין למשך שארית זמן הדגירה.