JoVE Encyclopedia of Experiments
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:06 דק' • September 26th, 2025
התחילו עם צלחת אגר המכילה מושבות Mycobacterium tuberculosis הגדלות על מדיום מועשר בחומרים מזינים.
חסנו מושבה בודדת למרק עם תוספי תזונה ודגרו עם תסיסה לצמיחה אחידה.
אפשר לתרבית להגיע לשלב הלוגריתמי המאוחר, שבו התאים פעילים מבחינה מטבולית.
פיפטו נפח קטן על צלחת אגר מועשרת, מורחים אותו באופן שווה ודוגרים עד שנוצרת שכבת חיידקים רציפה.
הרטיבו ספוגית סטרילית עם מדיום מינימלי דל ברזל (LIMM) ואספו את החיידקים.
תלו אותם במיכל פלסטיק המכיל LIMM כדי למנוע זיהום ברזל.
הוסף חומר פיזור למניעת גושים ודגירה מבלי לרעוד.
בתנאים מגבילים ברזל, חיידקים מפעילים תגובות לחץ ומייצרים סידרופורים בציטופלזמה.
אלה נארזים בשלפוחיות חוץ-תאיות ומשוחררים לסביבה.
סידרופורים לוכדים ברזל ומסייעים לחיידקים לשרוד.
מערכת זו מדגישה הסתגלות והישרדות מיקובקטריאלית בתנאים מוגבלים בברזל
יש לחסן מושבה אחת של MTB בשני מיליליטר של מדיום מרק מיקובקטריאלי בתוספת העשרת ADN. דגירה עם תסיסה ב-37 מעלות צלזיוס. כאשר יש צמיחה נראית לעין, חלץ שני מיליליטר מהתרבית ומדוד את ה-OD 540 על ספקטרופוטומטר.
עצור את הדגירה כאשר ה-OD 540 מגיע ל-0.8 מה שמציין את השלב הלוגריתמי המאוחר. מורחים 200 מיקרוליטר מהתרבית הלוגריתמית המאוחרת על צלחות האגר המיקובקטריאליות בתוספת 0.2 גליצרול, 0.5% טווין 80 ו-ADN. חסנו לפחות חמש צלחות.
דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ואחרי שבוע, גידול החיידקים נראה כשכבה מתלכדת. לאחר מכן הרטיבו צמר גפן סטרילי במדיום מינימלי ברזל נמוך.
השתמש במקלון זה כדי לאסוף חיידקים מצלחות האגר. חסנו את החיידקים ב-100 מיליליטר של מדיה מינימלית דלת ברזל בשפופרת. אסוף מספיק חיידקים להכנת תרחיף עם OD 540 של אחד.
יש לדלל את המתלה 10 פעמים לליטר אחד עם מדיום מינימלי ברזל נמוך ולחלק אותו לשני בקבוקי פלסטיק סטריליים. לאחר מכן, העבירו שני מיליליטר מהתרבות לצינור תרבית של חמישה מיליליטר. הוסף 10 מיקרוליטר של 10% נפח לפי נפח tyloxapol.
דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 14 יום.