בידוד והעשרה של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בקרום החיצוני מחיידקים

התחל בחיסון מושבה של חיידקים מהונדסים גנטית למדיום נוזלי.

חיידקים אלה מבטאים חלבון היתוך פלואורסצנטי בקרום החיצוני, שכבת הגנה חיצונית.

דגירה כדי שהחיידקים ישחררו שלפוחיות חוץ-תאיות (EVs), ננו-מבנים הקשורים לממברנה המעורבים בתקשורת בין-תאית, המשלבים את החלבון הפלואורסצנטי.

העבירו את התרבית לבקבוק וצנטריפוגה במהירות נמוכה כדי לגלול את התאים.

העבירו את הסופרנטנט המכיל EVs, חלבונים תאיים ופסולת תאים. צנטריפוגה במהירות גבוהה, והסר את הסופרנטנט המכיל פסולת.

סננו את הסופרנטנט דרך ממברנה כדי לחסל את כל החיידקים והפסולת שנותרו.

לחסן דגימה על אגר ולדגור אותה. היעדר היווצרות מושבת חיידקים מאשר את היעדרם של חיידקים.

העבירו את התמיסה למכשיר אולטרה-סינון עם ממברנה חדירה למחצה וצנטריפוגה כדי ללכוד את ה-EVs תוך סילוק חלבונים קטנים יותר.

אסוף את הרכבים החשמליים המרוכזים בצינור לניתוח במורד הזרם.

התחל בחיסון מושבות בודדות של Escherichia coli ל-250 עד 1000 מיליליטר של מרק Luria-Bertani, או LB, באמצעות לולאה סטרילית. לאחר מכן, דגרו את התרבית באופן אירובי באינקובטור רועד ב-300 סיבובים לדקה ו-37 מעלות צלזיוס. לאחר 48 שעות דגירה, הבהירו את מדיום תרבית החיידקים על ידי העברת תרביות התאים לבקבוקי צנטריפוגה מפוליפרופילן בנפח 500 מיליליטר לצנטריפוגה ברוטור בעל קיבולת גדולה וזווית קבועה בארבע מעלות צלזיוס ופי 5,000 G למשך 15 דקות.

העבירו את הסופרנטנט לבקבוקי צנטריפוגה נקיים על ידי מזיגה בזהירות לצנטריפוגה ב-10,000 פעמים G למשך 15 דקות. לאחר מכן, העבירו את הסופרנטנט למכשיר סינון מונע ואקום פוליאתרסולפון בגודל מתאים וחברו את מכשיר הסינון לאספקת קיר ואקום. אם קצב הסינון יורד משמעותית, העבר את החומר הלא מסונן למכשיר חדש.

ניתן לאחסן את המדיום המסונן בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה או לעבד אותו באופן מיידי. כדי לבדוק את ההסרה המלאה של התאים הברי קיימא, יש לפזר כמות גדולה של הסופרנטנט המסונן על צלחות אגר מתאימות ולהבטיח היעדר מושבות לאחר הדגירה בתנאים אופטימליים לזן החיידקים. לריכוז המדיום המסונן בנפח של 100 מיליליטר, טען 90 מיליליטר של מדיום תרבית מסונן על המאגר של מכשיר אולטרה-סינון צנטריפוגלי עם חיתוך משקל מולקולרי של 100 קילודלטון וצנטריפוגה של המדיום ברוטור דלי מתנדנד בארבע מעלות צלזיוס ו-2,000 פעמים G למשך מרווחים של 15 עד 30 דקות עד שנפח המדיום במאגר העליון מרוכז לפחות מ-0.5 מיליליטר.

כדי למלא את המאגר בכל מדיום תרבית מסונן שנותר, הסר את הזרימה בתחתית המכשיר כדי לאזן מחדש. אם הצמיגות של המדיום המרוכז במאגר מוגברת באופן ניכר, יש לדלל את המדיום עם PBS ולהתרכז מחדש על ידי צנטריפוגה כדי להפחית כל שלפוחית לא חוץ-תאית, או חלבוני EV, קטנים יותר מחתך המשקל המולקולרי של 100 קילודלטון. לאחר מכן, העבירו את המדיום המרוכז לצינור קשירה דל חלבון כדי לאחסן בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.