הכנת חיסון חיידקי חד-תאי

קחו תרבית פעילה מטבולית של Mycobacterium marinum. זה מבטיח כדאיות חיידקים גבוהה ומצב פיזיולוגי אופטימלי.

צנטריפוגה את התרבות כדי לגלול את החיידקים.

השליכו את עודפי הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה במדיה טרייה המכילה חומר פיזור.

העבירו את המתלה לצינורות מיקרו-צנטריפוגה וסוניקט בתנאים מבוקרים.

סוניקציה משבשת אגרגטים של חיידקים ומפזרת את התאים, וכתוצאה מכך מתלה חד-תאי בר-קיימא.

אסוף את התרחיף הסוניקטיבי במזרק והעביר אותו דרך מסנן ממברנה כדי להסיר את כל הגושים שנותרו, מה שמבטיח אוכלוסיית תאים בודדים אחידה.

בעזרת ספקטרופוטומטר מודדים את הצפיפות האופטית של מתלה החיידקים.

יש לדלל את התרחיף בחומר טרי המכיל חומר הקפאה כדי להגיע לריכוז החיידקים הרצוי תוך שמירה על כדאיות התאים.

בחר את המתלה החד-תאי הסופי ואחסן אותו בטמפרטורות נמוכות במיוחד. ה-cryoprotectant מסייע בשמירה על כדאיות החיידקים במהלך אחסון לטווח ארוך.

לאחר החיסון על פי כתב היד, צנטריפוגה של התרבית ב-3000 פעמים G למשך 10 דקות כדי לאסוף את ה-Mycobacterium marinum ככדור. השליכו את כל הסופרנטנט מלבד 300 מיקרוליטרים, ותלו מחדש את הגלולה.

הוסף שלושה מיליליטר של מדיום 7H9 עם 10% גליצרול כדי להשעות מחדש את הגלולה, ולאחר מכן סוניקציה של התרחיף באמבט מים ב-100 וואט, עם 15 שניות הפעלה ו-15 שניות כבוי, למשך שתי דקות בסך הכל כדי להשיג הומוגנאט של תא בודד. העבירו את תרחיף החיידקים למזרק של 10 מיליליטר, והעבירו דרך מסנן של חמישה מיקרון כדי להסיר גושי חיידקים. בעזרת ספקטרופוטומטר מודדים את הצפיפות האופטית של המתלה ומדללים אותו במדיה 7H9 המכילה 10% גליצרול עד OD 600 בבת אחת.

מחלקים את התרחיף ל -10 מיקרוליטר אליציטות, ושומרים במקפיא שלילי 80 מעלות צלזיוס לשימוש נוסף.