כימות עמילואידים הנגרמים על ידי זיהום חיידקי באמצעות פלואורסצנציה של תיופלבין T

קחו קובטה המכילה תמיסת עבודה של תיופלבין T, צבע פלואורסצנטי ספציפי לעמילואיד, מומס במי מלח עם חוצץ פוספט.

הנח את הקובט בספקטרופלואורומטר ורשום את אות הקרינה הבסיסי.

השהה את הסריקה והסר את הקובטה.

הוסף את התרבית המעוקרת בפילטר שנאספה מתאי אנדותל ריאתיים הנגועים בחיידקי פסאודומונס אלימים.

הסופרנטנט מכיל אגרגטים עמילואידים, שהם חלבונים מקופלים בצורה לא נכונה ועשירים ביריעות בטא.

מערבבים בעדינות את התוכן על ידי היפוך כדי להבטיח פיזור אחיד.

טען מחדש את הקובט בספקטרופלואורומטר והמשך את הסריקה כדי לקבל אות פלואורסצנטי מבוסס זמן.

תיופלבין T נקשר במיוחד לעמילואידים עשירים ביריעות בטא, מה שמוביל לפלואורסצנטיות מוגברת.

בצע סריקת פלואורסצנטיות באמצעות אותן הגדרות.

עלייה בקרינה ביחס לקו הבסיס מצביעה על נוכחות ושפע יחסי של עמילואידים הנגרמים על ידי זיהום בתרבית.

כדי לכמת את העמילואידים בתוך הסופרנטנט, הוסף 20 מיקרוליטר של תמיסת מלאי 50X תיאופלווין T שהוכנה ומסוננת טרי למיליליטר אחד של PBS בקובטה ספקטרופוטומטרית של מיליליטר אחד, וטען את הדגימה המדוללת על ספקטרופלואורומטר.

מדוד את פליטת הקרינה הבסיסית באמצעות עירור של 425 ננומטר. סריקת פליטת הקרינה מ-450 ל-575 ננומטר במרווחים של שני ננומטרים. לאחר מכן הגדר את המכשיר לבצע סריקת זמן-lapse באמצעות עירור של 425 ננומטר ופליטה של 482 ננומטר עם רכישת נתונים כל 0.2 שניות למשך 60 שניות.

השהה את הסריקה לאחר 20 שניות והוסף לקובט 10 מיקרוליטר של סופרנטנט מעוקר מסנן. לאחר ערבוב על ידי היפוך, טען מחדש את הקובט על הספקטרופלואורומטר והמשך את הסריקה מבוססת הזמן למשך 40 השניות האחרונות. עם השלמת הזמן, בצע סריקת ספקטרום פליטות פלואורסצנטיות סופית באמצעות הגדרות הסריקה המקוריות.