אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:27 דק׳ • September 26th, 2025
התחל בתרבית של Pseudomonas aeruginosa רקומביננטי במדיום ברירה אנטיביוטי.
חיידקים אלה מכילים פלסמיד שאינו משכפל המשולב בגנום ליד גן המטרה החיידקי המיועד למחיקה.
האינטגרציה התרחשה באמצעות רצפים הומולוגיים המשותפים בין הפלסמיד לגנום, וכתוצאה מכך רקומבינציה מוצלבת אחת.
הפלסמיד מקודד גן עמידות לאנטיביוטיקה ואת הגן sacB , המעניק רגישות לסוכרוז.
פס את החיידקים על מדיום המכיל סוכרוז אך חסר אנטיביוטיקה ודגירה.
ללא לחץ אנטיביוטי, מתרחש רקומבינציה שנייה, או הצלבה כפולה, בין אזורים הומולוגיים, וכורת את הפלסמיד וגן המטרה.
במהלך ריבוי החיידקים, הפלסמיד שנכרת אינו מועבר הלאה, מה שהופך את החיידקים לסובלניים לסוכרוז.
מדביקים את החיידקים על מדיום לא סלקטיבי ומדיום המכיל סוכרוז או אנטיביוטיקה, ודוגרים.
גידול במצע הלא סלקטיבי והסוכרוז, אך לא במדיום האנטיביוטי, מאשר הצלבה כפולה מוצלחת.
התחל בגידול מושבות רקומביננטיות בודדות ב-Pseudomonas Isolation Broth, או PIB. יש לחסן ולפספס 10 מיקרוליטר מכל תרבית על צלחות PIA מחוממות מראש, בתוספת 10% סוכרוז. לאחר מכן דגרו את הצלחות למשך הלילה בחום של 37 מעלות צלזיוס.
למחרת, הוציאו את הצלחות מהחממה ובדקו אם הן צומחות. המושבה העמידה לסוכרוז צריכה להיות רקומביננטים מוצלבים כפולים. השתמשו בקיסמים סטריליים כדי להדביק לפחות 20 מושבות על צלחות PIA שחוממו מראש, PIA בתוספת 10% סוכרוז ו-PIA בתוסף קרבניצילין.
דגרו את הצלחות למשך הלילה ובדקו אותן לצמיחה למחרת. רקומביננטים מוצלבים כפולים אמיתיים יהיו רגישים לקרבניצילין ועמידים לסוכרוז.