הדמיית זמן-lapse פלואורסצנטית של מחזור החיים של Streptomyces venezuelae

קח צלחת מיקרופלואידית עם באר המכילה נבגים של Streptomyces venezuelae, חיידק היוצר קורים.

בארות ייעודיות אחרות מכילות מדיום עשיר בחומרים מזינים או מבוזבז.

הנבגים נגזרים מזן המבטא חלבוני DivIVA ו-FtsZ פלואורסצנטיים, המתמקמים בקצות ההיפים ובקירות צולבים, בהתאמה.

מרחו שמן טבילה על עדשת האובייקט של מיקרוסקופ הפוך ועל חלון ההדמיה של הצלחת.

התקן את הצלחת על שלב המיקרוסקופ והתחל בהדמיית זמן-lapse.

טען את הנבגים לתא התרבות של הצלחת.

לאחר מכן, הכניסו את המדיום העשיר בחומרים מזינים כדי להתחיל נביטת נבגים.

ככל שהקורים גדלים, DivIVA מצטבר בקצות הקור, בעוד ש-FtsZ יוצר טבעות מפוזרות בקירות הצולבים.

לאחר מכן, עבור למדיום המושקע. המחסור בחומרים מזינים במדיום זה תומך בנבגים.

בהנבטת קורים, מוקדי DivIVA נעלמים, ו-FtsZ מתארגן מחדש לסולם רגיל של טבעות חלוקה, ויוצר מחיצות נבגים.

עם הזמן, היעלמות הקרינה של FtsZ באותם קורים מאשרת את השלמת הנבגים.

מחממים מראש את החדר הסביבתי ל -30 מעלות צלזיוס מראש.

לאחר מכן הפעל את המיקרוסקופ ואת תוכנת בקרת המיקרוסקופ. שים יעד טבילה בשמן עם צמצם מספרי גבוה ואשר כי המסננים המתאימים והמראות הדיאגרמטיות המוגדרים לרכישת תמונות ניגודיות של הפרעות דיפרנציאליות, יחד עם התמונות של היתוך החלבון הפלואורסצנטי הצהוב והאדום נמצאים במקום. הנח טיפה של שמן טבילה לתוך המטרה ולתחתית חלון ההדמיה גם על הצלחת המיקרופלואידית.

התקן בזהירות את המכשיר המיקרופלואידי האטום על הבמה של המיקרוסקופ ההפוך ואבטח אותו למקומו. השתמש בסמני המיקום המוטבעים כדי להביא את חלון ההדמיה של תא התרבית המיקרופלואידית למיקוד. התמקד בחלק השמאלי ביותר של תא הזרימה הראשון המסומן A, ולאחר מכן הזז את השלב למלכודת בגודל חמש, המתאים לגובה המלכודת של 0.7 מיקרומטר.

בתוכנה המיקרופלואידית, הגדר את המערכת לטעון תאים מבאר הכניסה שמונה בארבע psi למשך 15 שניות. לאחר הפעלת התהליך, בדוק את צפיפות התאים בתא התרבית על ידי הזזת השלב על פני חלון ההדמיה. אם לא נלכדו נבגים, חזור על שלב טעינת התאים או לחילופין, הגדל את לחץ הטעינה ו/או הזמן עד להשגת צפיפות התא הרצויה של 1 עד 10 נבגים לכל חלון הדמיה.

הקפד להימנע מעומס יתר על תא התרבית. לאחר מכן, התחל את תוכנית הזרימה שהוכנה קודם לכן בתוכנת הבקרה ואפשר לצלחת המיקרופלואידית להתייצב בחום למשך שעה אחת בשלב המיקרוסקופ לפני תחילת רכישת התמונה. בתוכנת בקרת המיקרוסקופ, הגדר רכישה רב מימדית כדי לצלם תמונות מרובות במיקומי שלבים מרובים לאורך זמן על ידי ציון תחילה של ספרייה לשמירה אוטומטית של קבצי התמונה.

לאחר מכן, עבור להגדרות התאורה והזן הגדרות תאורה אופטימליות שנקבעו מראש עבור כל מבנה ספציפי. לאחר מכן הגדר סדרת זמן לרכישת תמונות כל 40 דקות למשך 24 שעות. על מנת לקבוע את מיקומי הבמה ולהגדיר את המיקוד האוטומטי, סרוק את תא התרבות ואחסן את מיקומי הבמה עבור כל עמדת הדמיה מעניינת.

ודא שהמיקומים החד-שלביים ממוקמים רחוק מספיק זה מזה כדי למזער הלבנת תמונות ורעילות צילום. לאחר אימות קואורדינטות ה-Z של עמדות הבמה שנבחרו, הפעל את המיקוד האוטומטי של החומרה. לאחר מכן התחל את ניסוי ה-time-lapse בתוכנת בקרת המיקרוסקופ.

עצור את רכישת התמונה לאחר 24 עד 30 שעות, או כאשר הקורים באזור העניין התמיינו לנבגים. לאחר מכן עצור את תוכנית הזרימה בתוכנה ופרק את המכשיר המיקרופלואידי. הכן את הצלחת המיקרופלואידית המשומשת לאחסון לטווח קצר על ידי הוצאת כל המדיום שנותר מבארות הכניסה, באר הפסולת וטעינת התא היטב.

לאחר מכן מלאו את הבארות המשומשות של נתיב A ובארות של הנתיבים שאינם בשימוש ב-PBS סטרילי. לבסוף, אטמו את הצלחת בניילון אגס כדי למנוע את התייבשותה. ואחסן את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס.