ניטור זיהום חיידקי ואספקת חלבון אפקטור בתאי הצמח

התחל עם צמח ניסיוני עם אזורי עלים מהונדסים גנטית המבטאים שברים גדולים שאינם פלואורסצנטיים של חלבון פלואורסצנטי ירוק או sfGFP.

הזרקו לאזורים ששונו חיידקי Pseudomonas המכילים חלבוני אפקטור המתויגים עם השבר הקטן שאינו פלואורסצנטי של sfGFP.

דגירה כדי לאפשר אינטראקציה בין החיידקים לתאי העלים.

באמצעות מערכת הפרשה מיוחדת, Pseudomonas מעביר את חלבוני האפקטור המתויגים לתוך הציטוזול של העלה.

הקרבה בין שברי ה-GFP הגדולים והקטנים מאפשרת את הרכבתם ל-sfGFP פלואורסצנטי פונקציונלי, אשר לאחר מכן עובר לקרום הפלזמה.

לאחר הדגירה יש להוציא דיסקיות עלי מהאזורים המוזרקים.

דמיין את הדיסקים הללו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר.

בתחילה, דמיין את דיסקת העלה בעוצמת לייזר נמוכה כדי למזער את האוטו-פלואורסצנטיות. לאחר מכן, הגדל את עוצמת הלייזר כדי לשפר את הנראות.

הקרינה הירוקה מאשרת זיהום חיידקי מוצלח ואספקת חלבון אפקטור לתאי הצמח.

עבור עלי Nicotiana benthamiana , הסתננו לתרחיף Pseudomonas לאותו אזור שבו חדר האגרובקטריום יומיים קודם לכן.

לבסוף, גזרו דיסק עלים מהעלים המחוסנים בפסאודומונס. בנקודות זמן ספציפיות לאחר חדירת Pseudomonas, השתמש במערכת סריקת לייזר קונפוקלית כדי לצלם שני דיסקי עלים של שני סנטימטרים רבועים מהצמח הבודד. התבוננו בתאים הרחק מחור ההסתננות כדי למנוע תאים מתים שנהרגו מפציעה.

אפקטורים שהועברו מהחיידקים קיימים רק בכמויות קטנות מאוד. לכן, אתה יכול להגדיל את עוצמת הלייזר ולהשיג פליטת פלואורסצנטיות כדי לזהות אות פלורסנט. עם זאת, אל תגזים כדי להימנע מלכידת אות כוזב מאוטופלואורסצנטיות מתאי הצמח.