בידוד חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה מדגימת מים לאנליזה מולקולרית

התחל עם דגימת מים המכילה חיידקים הנישאים במים, וסנן אותה כדי להסיר פסולת.

העבירו את התסנין המדולל לצלחות אגר דלות בחומרים מזינים, כל אחת בתוספת אנטיביוטיקה ספציפית. מורחים את הסינון ודוגרים.

חיידקים הנושאים גן ספציפי לעמידות לאנטיביוטיקה גדלים על לוחות האנטיביוטיקה המתאימים ויוצרים מושבות.

ספרו את המושבות כדי לקבוע את היחידות היוצרות מושבה (CFUs), המייצגות את מספר החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה.

בחר מושבה אחת מכל צלחת ותלה אותה במים מזוקקים סטריליים.

מחממים את התרחיף כדי לשחרר את התאים ולשחרר תוכן תוך-תאי, כולל DNA חיידקי המכיל את הגן העמיד לאנטיביוטיקה.

צנטריפוגה של הצינורות כדי להפריד את הפסולת ולאסוף את הסופרנטנט שמכיל דנ"א.

הוסף ריאגנטים להגברה ל- DNA שחולץ.

הנח את הצינורות במחזור תרמי והפעל את התוכנית כדי להגביר אזור ספציפי של DNA חיידקי.

ה-DNA המוגבר מוכן לניתוח רצף כדי לזהות את גן העמידות לאנטיביוטיקה.

עבד את דגימת המים באופן אספטי על ידי סינון דרך מטלית מוסלין סטרילית כדי להסיר כל חומר חלקיקי. לאחר מכן, יש לדלל באופן סדרתי את דגימת המים המסוננים להמשך ניתוח. כדי לקבוע את ספירת החיידקים העמידים לאנטיביוטיקה, הוסף את האנטיביוטיקה בנפרד לצינורות המכילים 20 מיליליטר אגר R2A מותך סטרילי ששונה בערך ב-40 מעלות צלזיוס.

מערבבים לערבב באופן אחיד ויוצקים על צלחות פטרי סטריליות לפני שהאגר מתמצק. מורחים 100 מיקרוליטר של תרחיף חיידקים על האנטיביוטיקה המכילה צלחות ששונו באגר R2A. דגרו את הצלחות בטמפרטורה של 35 עד 37 מעלות צלזיוס למשך 48 שעות, ולאחר מכן קבעו את ספירת החיידקים.

כדי להכין את תבנית ה-DNA מהמבודדים ל-PCR, באמצעות קיסם סטרילי, קחו מושבה טהורה מבודדת אחת של המבודד הגדל על צלחת פטרי. השעו את מושבת החיידקים ב-100 מיקרוליטר מים מזוקקים כפולים סטריליים בצינור מיקרו צנטריפוגה והרתיחו אותה באמבט מים רותחים או באמבטיה יבשה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 100 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה את התרחיף ב-10,000 גרם למשך שתי דקות כדי לגלול את הפסולת ולהעביר את הסופרנטנט לצינור מיקרו-צנטריפוגה סטרילי טרי לשימוש כתבנית ה-DNA הגולמי.

כדי להגביר את אזור V3 של הגן 16S rRNA על ידי PCR, הכינו 40 מיקרוליטר מתערובת התגובה בצינור PCR. הנח את הצינור בבלוק התרמי, והפעל את התוכנית המתאימה במחזור התרמי PCR.