מערכת גידול משותף לחקר התגובות המולקולריות של מארחי צמחים וחיידקים המקיימים אינטראקציה

קח מיכל המכיל מדיום גידול סטרילי עם pH חומצי.

העבירו מסך רשת עם שתילי צמחים למיכל.

אטמו עם מכסה וסרט נקבובי כדי לשמור על סטריליות תוך מתן אפשרות להחלפת גזים.

דגירה עם טלטול כדי לאוורר את המדיום.

בדוק את המדיום כדי לבדוק אם אין עכירות, מה שמעיד על כך שאין זיהום חיידקי.

אתר דגימה על צלחת תרבית ודגר אותה כדי להתבונן בחוסר גידול חיידקים, המאשר את היעדר חיידקים מזהמים.

לחסן עם Agrobacterium, פתוגן צמחי, ולדגור.

מולקולות איתות שמקורן בשורש הצמח וה-pH החומצי מפעילים חלבון חיישן הקשור לממברנת חיידקים.

ההפעלה גורמת לביטוי גנים, ומייצרת חלבונים לחיבור חיידקים למשטחי שורש.

לאחר החיבור, אגרובקטריום מעביר מקטע DNA, המכונה העברת DNA (T-DNA), לתאי הצמח באמצעות מערכת הפרשה.

עם השילוב בגנום הצמח, ה-T-DNA מסנתז מולקולות איתות המשפרות את קולוניזציה של חיידקים.

במכסה זרימה מעוקר, שפכו 18 מיליליטר של מדיום MS נוזלי חיטוי למיכלי זכוכית גליליים סטריליים עם מכסים סטריליים.

לאחר מכן, השתמש במלקחיים סטריליים כדי להעביר בעדינות כל ריבוע רשת עם שתילים בני 10 עד 14 יום מצלחת הפטרי של מדיום מוצק למחצה למיכל גלילי הידרופוני. השתילים המוצגים כאן הם אספסת. אטום את המכסים על המיכלים באמצעות סרט כירורגי נקבובי.

לאחר מכן, טפחו את השתילים בטמפרטורה של 22 עד 24 מעלות צלזיוס עם תקופת צילום של 16 שעות ורעידות ב -50 סל"ד. לפני החיסון, בדוק היטב את המיכל עם שתילים לאיתור כל זיהום פוטנציאלי. המדיום במיכלים הלא מזוהמים צריך להיות שקוף ושקוף.

אם הטנקים מעוננים מזיהום, השליכו אותם וספרו את שאר המיכלים. דגימו 20 מיקרוליטר של מדיום הידרופוני מכל מיכל ממוספר ואתרו אותו על צלחת פטרי עם מרק לוריא או אגר LB. דוגרים את המנה בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך 28 שעות.

יש לחסן מיד כל מיכל הידרופוני ממוספר ב-50 מיקרוליטר של תרחיף הטומפאקיות Agrobacterium לכל מיכל הידרופוני ממוספר. לטפח במשותף את השתילים ואת חיידק A. tumefacians בטמפרטורה של 22 עד 24 מעלות צלזיוס עם תקופת צילום של 16 שעות ורעידות ב-50 סל"ד. בדוק את צלחת ה-LB המנומרת לאחר 12 ו-28 שעות דגירה כדי לוודא את הסטריליות של מצע הגידול ההידרופוני.

אם יש זיהום כלשהו, אל תשתמש במיכל הממוספר המתאים המחוסן בחיידקים לבדיקות נוספות במורד הזרם.