אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:41 דק׳ • September 26th, 2025
התחל עם גלולה חיידקית. החיידקים מכילים גן המקודד לחלבון יוזם, אך חסרים גן עמידות לאנטיביוטיקה.
השעו מחדש את הגלולה במים צוננים כדי למזער את התדרדרות התאים.
קח פלסמיד הנושא גן עמידות לאנטיביוטיקה וגן מטרה. פלסמיד זה נקרא פלסמיד מתאבד מכיוון שהוא אינו יכול להשתכפל ללא החלבון היוזם.
הוסף את הפלסמיד לתרחיף החיידקים.
העבירו את המתלה לקובט צונן.
התחל אלקטרופורציה על ידי הפעלת דופק מתח גבוה המשבש באופן חולף את קרום החיידקים, ומאפשר לפלסמיד להיכנס.
מוסיפים אמצעי התאוששות ומעבירים את התערובת לצינור תרבית.
דגירה עם טלטול.
קח צלחת אגר המכילה את האנטיביוטיקה וצלח את התרבית.
חלבון יוזם החיידקים נקשר למקור השכפול, ומאפשר לפלסמיד לשכפל ולבטא חלבון עמידות לאנטיביוטיקה.
זה מאפשר לחיידקים עם הפלסמיד לשרוד ולגדול, מה שמקל על הגברת הפלסמיד.
גלולה את תרבית החיידקים על ידי צנטריפוגה ב-5,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. השעו את הגלולה במים מזוקקים צוננים וחזרו על תהליך הניקוי פעמיים נוספות.
העבירו את תרחיף החיידקים לצינורות מיקרופוגה וחזרו על הצנטריפוגה ב-14,000 פעמים G וארבע מעלות צלזיוס למשך חמש דקות. לאחר השעיית הגלולה במים צוננים, מוסיפים כ-3.5 מיקרוליטר מתערובת הקשירה ודוגרים על קרח למשך חמש דקות. העבירו את התכולה לקוביית אלקטרופורציה צוננת במרווח של שני מילימטרים.
לאחר האלקטרופורציה מוסיפים את מדיום ה-SOC ומעבירים את התוכן לצינור תרבית. דגירה למשך שעה בחום של 30 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-200 סל"ד. צלחת את התאים שעברו טרנספורמציה על לוחות אגר LB בתוספת כלורמפניקול.