בידוד של חיידקים גראם-שליליים עם החדרת טרנספוזון גנומי

התחל בהפשרת תרבית קפואה של אוכלוסיית החיידקים הגראם-שליליים של התורם והמקבל על קרח.

התאים הנמענים נושאים טרנספוזונים, מקטעי DNA קצרים הכוללים גן עמידות לאנטיביוטיקה קנמיצין. טרנספוזונים אלה משולבים באופן אקראי בגנום המארח.

הוסף את התרבית לצלחת אגר עשירה בחומרים מזינים המכילה קנמיצין אך ללא חומרים מזינים ספציפיים לתורם.

הוסף חרוזים סטריליים וסובב בעדינות את הצלחת כדי להפיץ את התרבות בצורה אחידה.

הסר את החרוזים ודגירה. חיידקים נמענים משתמשים בחומרים מזינים, אך רק אלה עם טרנספוזונים משולבים מתנגדים לקנמיצין, מה שמוביל להיווצרות מושבה.

החיידקים התורמים והמקבלים ללא טרנספוזונים אינם מצליחים לגדול.

ספור יחידות יוצרות מושבה כדי להעריך את מספר החיידקים הנמענים עם החדרות טרנספוזונים ייחודיות.

הוסף מדיה טרייה ואסוף את אוכלוסיית החיידקים.

צנטריפוגה כדי לגלול את החיידקים ולהשליך את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הגלולה במדיה עם חומר קריאופרוטקנט כדי לשמר את כדאיות החיידקים.

הפשירו חלק מההזדווגות הקפואה על הקרח. לאחר מכן, השתמש בחרוזי זכוכית סטריליים כדי לפזר 150 מיקרוליטר מהדילול, על כל צלחת אגר לוריא-ברטני בגודל 30 על 150 מילימטר, בתוספת קנמיצין.

השלך את הצינור המשומש המכיל הזדווגות עודפת, ודגר צלחות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 14 שעות. לאחר הדגירה ספרו את היחידות היוצרות מושבה על כל צלחת כדי להעריך את סך המוטציות בספריית הטרנספוזונים. ספור 20% משלוש צלחות לפחות כדי לקבוע את אומדן ספירת המושבה עבור כל קבוצת הלוחות.

לאחר חישוב תפוקת המושבה המשוערת, הוסיפו שלושה עד חמישה מיליליטר LB לכל צלחת, וגרדו את החיידקים באמצעות כלי גירוד סטרילי. משוך מתלים חיידקיים מכל הלוחות לצינורות חרוטיים של 50 מיליליטר, וגלגל את המתלים על ידי צנטריפוגה ב-5,000 פעמים G, למשך שבע דקות. השליכו את הסופרנטנט והשעו מחדש את הגלולה בחמישה מיליליטר LB, בתוספת 30% גליצרול.

לאחר מכן, הכינו מיליליטר אחד של ספריית הטרנספוזונים בקריוביאלים ואחסנו אותם במינוס 80 מעלות צלזיוס.