Name: טיהור יעיל של ה-DNA פלסמיד מתרבויות פרוקריוטים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-05T17:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: למד שיטה יעילה לטיהור DNA פלסמיד מחיידקי E. coli תוך שימוש בצלחות Deep Well ומסנני DNA. השיטה מספקת תפוקה גבוהה של DNA איכותי בעלות נמוכה יותר מערכות מוכנות מראש.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. Lysate עמילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול E. coli תרבויות טרנספורמציה עם DNA פלסמיד הרצוי צלחות באר עמוקה (1 מ"ל של תרבות / טוב) במרק לוריא עם אנטיביוטיקה מתאימה לילה בשעה 37 ° C עם רעד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה E. coli בצלחת תרבות XG ב 5000 במשך 10 דקות, ולאחר מכן supernatant למזוג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend כל גלולה ב הצפת 100 Resuspension μL (50 mM טריס-HCl, pH 8.0, 10 mM EDTA, 100 מיקרוגרם / מ"ל ​​RNase A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 הצפת תמוגה μL / היטב (200 mM NaOH, SDS 1%) וללחוץ באמצעות צלחת שייקר במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת 100 μL / גם הצפת נטרול (3.0 Acetate M אשלגן, pH 5.5) ולנער במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת lysate התא lysate צלחת הבהרה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים צלחת DNA מחייבת על גבי צלחת 350 אוסף μL ומקום לתוך התחתון של סעפת ואקום. להרכיב סעפת ואקום (ראה איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Lysate הבהרה צלחת מניחים על גבי מכשיר ואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ב 10 ואקום בו כספית (0.34 בר) ולאסוף תסנין לתוך הצלחת ה-DNA מחייבת. אין להשתמש ואקום גדול מ 12 פנימה כספית. (0.41 בר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק סעפת ואקום. מקום 2 מ"ל איסוף פסולת צלחת התחתון של המנגנון. </li></ol> 2. איגוד ה-DNA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזז את הצלחת ה-DNA מחייבת לחלק העליון של סעפת (ראה איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף חוצץ 300 μL / עקידת היטב (6 Guanidine M-HCl) ו פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ואקום [~ 5 פנימה כספית (0.17 בר) עבור ואקום איטי] וזורקים תסנין. DNA הוא עכשיו חייב הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף עם μL 400 / הצפת לשטוף היטב (80% אתנול). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ואקום, ואז להשליך את תסנין. מחק מיותר אם באמצעות 2 אוסף צלחת מ"ל או סינון ישירות פסולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על לשטוף פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם התחתון של צלחת לסנן על מגבת סופג לייבוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל ואקום שוב למשך 5-10 דקות, כדי להבטיח הסרת אלכוהול שיורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כתם למטה כדי להבטיח הסרה של טיפות אתנול. </li></ol> 3. ה-DNA elution <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 70 μL / גם הצפת elution (10 mM טריס-HCl, pH 8.0, 1 mM EDTA). אם ריכוז ה-DNA גבוה הוא הרצוי, נפח, ניתן להפחית עד 50 μL / היטב, אך את התשואה הכוללת הממוצעת תהיה נמוכה יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה את הצלחת בטמפרטורת החדר למשך דקה אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ה-DNA מטוהרים ניתן eluted ידי ואקום או צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטה אבק: מקום איסוף צלחת נקייה (DNase, RNase חינם) לתוך סעפת ואקום. צלחת מניחים לסנן על גבי סעפת ואקום, ואקום להחיל על 15 בו כספית (0.5 בר) לרגע 1 עד כל חיץ elution עבר דרך הצלחת ה-DNA מחייבת. איסוף DNA מטוהרים (ראה איור 3). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שיטה צנטריפוגה: טיהור מקום צלחת לסנן על גבי צלחת לאוסף צנטריפוגות נקי XG ב 1000 במשך 5 דקות. </li></ol> 4. ניתוח כמותי ואיכותי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדידת OD 260/280, לחשב ריכוז של DNA מטוהרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביצוע ניתוח agarose ג'ל של pDNA מטוהרים. </li></ol> 5. נציג תוצאות החיידק lysate הבהיר באמצעות צנטריפוגה מסורתיים AcroPrep מל מתקדם lysate הבהרה צלחות סינון הראו הפחתה ניכרת של פסולת חומרי המוצא. (איור 4). פלסמיד דנ"א בשלושה ריכוזים היה ממוסמר אל TE חיץ עברו את הצלחת lysate הבהרה AcroPrep לסנן מראש. השוואה בין ריכוז ה-DNA פלסמיד, טרום ופוסט סינון, מראה התאוששות ~ 100% (איור 5) בכל שלושת ריכוזי. כדי להדגים את ההתאוששות של ה-DNA של ה הבהיר coli DNA lysate, הפלסמיד היה ממוסמר אל lysate גולמי הבהיר מכן על ידי סינון. הדנ"א פלסמיד באותו התווסף סינון lysate התא הבא. אלקטרופורזה בוצעה על aliquots מכל מדגם (איור 6). להקה אחת, ברורה של אינטנסיביות דומה מכל מדגם מדגים מעט אם בכלל הפסד DNA במהלך שלב הסינון מבוסס הבהרה. תרבויות של E. coli המכילים DNA פלסמיד pCAT היו מטוהרים מן E. coli lysates באמצעות 350 של מל μL ו 1 מ"ל מחייב DNA צלחות סינון, כמו גם שני מותגים אחרים של 350 צלחות DNA μL מחייב. Purifications כל בוצעו כמפורט בפרוטוקול המומלץ של היצרן. ריכוז ה-DNA ואת התשואה הגבוהה ביותר הכולל נראים מ 1 מ"ל של מל DNA AcroPrep צלחת מתקדם מסנן טיהור (איור 7 ואת טבלה 2). למרות מתחרה W מציג גם ריכוז גבוה DNA (155 ng / μL), תשואה DNA הכולל הוא הנמוך ביותר (4.7 מיקרוגרם / טוב) עקב כמות התאוששות נמוך, ~ 30 μL. מתחרה M נתן את הריכוז הנמוך ביותר של ה-DNA ב 108 ng / μL עם תשואה כוללת של 5.6 מיקרוגרם / היטב. אגרOSE ניתוח בג'ל של דנ"א pCAT מטוהרים מן שלוש צלחות DNA שונה מחייב מוצג באיור 8. כל כרך מדגם שנאסף הותאם μL 65 לתקן הבדלים בנפח התאוששות לפני אלקטרופורזה. כל הדגימות להראות supercoiled DNA פלסמיד, אבל תשואה דנ"א מכל אחד צלחות סינון משתנה. איור 9 מציג את ה-DNA הוא מוכן לכל צורה supercoiled ויש ריכוז דומה. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig1.jpg" alt="איור 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 1"> באיור 1. האסיפה של סעפת אבק לבירור lysate. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig2.jpg" alt="איור 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 2"> איור 2. האסיפה של סעפת אבק עבור איגוד ה-DNA. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig3.jpg" alt="איור 3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 3"> איור 3. האסיפה של סעפת אבק עבור elution אבק. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig4.jpg" alt="איור 4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 4"> איור 4. סינון מפשט הבהרה המדגם. בשלושה עותקים דגימות של 300 μL של lysate גולמי הבהיר ידי סינון ואקום (350 AcroPrep μL מתקדם lysate הבהרה צלחת מסנן) או צנטריפוגה המסורתית. OD 320 נמדד לפני ואחרי בירור. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig5.jpg" alt="איור 5" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 5"> איור 5. התאוששות מלאה של pDNA לאחר מעבר דרך lysate AcroPrep צלחת מתקדם הבהרה הסינון. 300 μL חיץ TE מתובל pCAT של 25, 50 ו -100 מיקרוגרם / מ"ל. ריכוז ה-DNA והתאוששות לחשב OD 260 לפני ואחרי סינון, N = 2. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig6.jpg" alt="איור 6" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 6"> איור 6. השחזור של ה-DNA pCAT לאחר בירור. כמויות שוות של pUC19 זינק לתוך lysate לפני או אחרי הבהרה, ולאחר מכן מדולל 1 עד 10 חיץ TE. Loaded 2 μL / מסלול על 1.2% agarose ג'ל. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig7.jpg" alt="איור 7" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 7"> איור 7. תשואה גבוהה DNA פלסמיד ל-DNA היטב עם Acroprep מתקדם מעטה צלחת לסנן מחייב מאשר צלחות מתחרה. הדנ"א pCAT תשואה פלסמיד (OD 260) באמצעות דנ"א הצביעו על טיהור צלחות עם מ"ל 1 (מל ו-M מתחרה) או 1.5 מ"ל (מתחרה W) תרבות של לילה DH5α. טיהור באמצעות פרוטוקול מומלץ היצרן צלחת. ברים שגיאה לציין שגיאת התקן (n&gt; 6). <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig8.jpg" alt="איור 8" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 8"> איור 8. Agarose ניתוח בג'ל של דנ"א pCAT מטוהרים על הצלחת ה-DNA הצביע מחייב. 1.2% agarose ג'ל אלקטרופורזה של pDNA מטוהרים. דגימות משולב משלוש purifications נפרדים, eluate מותאם μL 65 אחרי, 1:10 טיהור בדילול מלא. Loaded 2 μL לכל נתיב. <img src="/files/ftp_upload/2407/2407fig9.jpg" alt="איור 9" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="איור 9"> איור 9. איכות ההתאוששות של דנ"א טהור דומה כאשר שיטות צנטריפוגה או ואקום משמשים אלקטרופורזה הסופי אוסף eluate ג'ל agarose של pDNA מטוהרים. פרוטוקול המומלץ של היצרן לקבלת AcroPrep צלחות מתקדם סינון בעקבותיו לטיהור pDNA. Elution בוצע על ידי צנטריפוגה XG ב 1000 במשך 5 דקות או ואקום עם 15 פנימה כספית (0.5 בר) במשך 2 דקות.

כותבי המאמר וידאו זה הם עובדי למדעי החיים מל אשר מייצרים את המכשיר ריאגנטים מובלט וידאו וטקסט.

אנו מתארים פרוטוקול קליל, יעיל של סינון צלחות AcroPrep מראש מקנה מספר יתרונות. שיטה זו מספקת מקסימום תשואות DNA פלסמיד כאשר מעובד בפורמטים מתקדם ידניות, חצי אוטומטיות, אוטומטיות או מלא AcroPrep. Prefilter משולב על הצלחת אישור lysate מספק סינון עקבית של דגימות, אפילו אלו המכילים רמות גבוהות של חלקיקים. הגיאומטריה היטב את התוצאות צלחת, שיעורי מהר סינון אחיד יותר על פני צלחת עם נפח לקיים מעקב מינימלי; ואת הגיאומטריה קצה פורקן מספק זרימה ישירה של דגימות לתוך צלחת מקלט בלי חששות של זיהום לחצות. חשוב לציין, קרום קיבולת גבוהה מחייב לוחית DNA המחייב של AcroPrep צלחות מתקדם סינון ממוטב התאוששות מקסימלית של ה-DNA באיכות גבוהה פלסמיד.

<table><tbody><tr><td>פלטת סינון AcroPrep Advance</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8175 (1 mL) או PN 8075 (350 &amp;#181;l)</td><td>סיב זכוכית 3 &amp;#x03BC;m וממברנת Supor&amp;#174; 0.2 &amp;#x03BC;m להבהרה</td></tr><tr><td>פלטת סינון AcroPrep Advance</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 8132</td><td>לקשירת DNA</td></tr><tr><td>סעפת ואקום (Vacuum manifold)</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 5017</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>Pall Corporation</td><td>PN 13157</td><td></td></tr></tbody></table>

טיהור יעיל של ה-dna פלסמיד מתרבויות פרוקריוטים

Streamlined Purification of Plasmid DNA From Prokaryotic Cultures

אנו מתארים את תהליך שלם של צלחות AcroPrep מתקדם סינון עבור 96 ההכנות פלסמיד, החל בתרבות פרוקריוטים וכלה DNA הטוהר גבוהה. בהתבסס על הסינון רב גם לקבלת אישור lysate חיידקי וטיהור DNA, שיטה זו יוצרת תהליך יעיל להכנת הפלסמיד. צלחות סינון המכיל סיליקה מבוסס מדיה יכול בקלות להיות מעובד על ידי צנטריפוגות סינון ואקום או להניב כמות ניכרת של DNA פלסמיד. ניתוח כמותי לקבוע את ה-DNA פלסמיד מטוהרים באופן עקבי באיכות גבוהה עם ממוצע OD 260/280 יחס של 1.97. בסך הכל, התשואות פלסמיד דנ&quot;א טהור להציע יותר עבור יישומים במורד הזרם, כמו רצף השיבוט. שיטה זו יעילה של השימוש צלחות AcroPrep מתקדם סינון מאפשר עיבוד ידני, חצי אוטומטי או אוטומטי מלא.

פרוטוקול זה הוא חלופה חסכונית הבהרה במקביל יעילה לטיהור פלסמיד דנ&quot;א מ<em&gt; א coli</em&gt; תרבויות. תהליך מתקדם AcroPrep מתחיל עם צלחת הבהרה אופטימיזציה lysate מסנן ואחריו טיהור על צלחת קיבולת גבוהה מחייב DNA לסנן מחייב.

טיהור יעיל של ה-DNA פלסמיד מתרבויות פרוקריוטים

אנו מתארים את התהליך המלא של שימוש בלוחיות סינון AcroPrep Advance להכנת 96 פלסמידים, החל מתרבית פרוקריוטית ועד לקבלת...

<a class="grey_button" href="/video/2711"> עברית </a>

streamlined-purification-of-plasmid-dna-from-prokaryotic-cultures

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

טיהור פלסמיד דנ&quot;א מ מושבות חיידקים באמצעות Miniprep Qiagen Kit

אנו מתארים שיטה לטיהור זיקה מתויגת-של חלבונים רקומביננטי באמצעות רובוטיקה נוזלית לטיפול. שיטה זו היא בדרך כלל ישימה לטיהור בקנה המידה הקטנה של חלבונים המתויגים המסיסים בפורמט תפוקה גבוהה.

טיהור תפוקה גבוהה של חלבונים רקומביננטי זיקה מתויגת-

כאן, מוצג פרוטוקול ליצירת כרומוזום מלאכותי חיידקי זיהומי המכיל cDNA באורך מלא של ה-RNA הגנומי החיובי של נגיף דלקת המוח היפני. ניתן להשתמש בפרוטוקול זה לבניית cDNA פונקציונלי של נגיפי RNA חיוביים אחרים, מה שהופך אותו לכלי גנומי רב עוצמה לחקר ביולוגיה של נגיפים.

חיידקים מלאכותיים כרומוזומים: Genomics כלי פונקציונלי לחקר חיובי גדיל RNA וירוסים

המיני-וקטור של ה-DNA הסגור קוולנטית ליניארית (LCC) הוא וקטור העברת גנים לא ויראלי המציע יעילות טרנספקציה גבוהה ורלוונטי לכל יישום העברת DNA. מערכת הייצור פשוטה, מהירה וניתנת להרחבה in vivo. הפרוטוקול הבא מספק הוראות חזותיות שלב אחר שלב לייצור מיני-מחרוזות DNA.

הפקה של DNA פעמיים תקועים Ministrings

מאמר זה מציג שיטה רגישה הנקראת Circle-Seq לטיהור DNA מעגלי חוץ-כרומוזומלי (eccDNA). השיטה כוללת טיהור עמודות, הסרת ה-DNA הכרומוזומלי הליניארי שנותר, הגברת מעגל מתגלגל ורצף תפוקה גבוהה. Circle-Seq ישים לסינון בקנה מידה גנומי של eccDNA איקריוטי ולחקר חוסר יציבות הגנום ושונות במספר העתק.

טיהור הגנום כולו של DNA המעגל extrachromosomal מתאי איקריוטיים

כאן, אנו מתארים שיטה לטיהור מתויג היסטידין pyrophosphokinase אנזימים וניצול כרומטוגרפיה שכבה דקה של סובסטרטים radiolabelled ומוצרים כדי assay עבור פעילות אנזימטי בתוך חוץ גופית. וזמינותו פעילות האנזים ישימה בהרחבה על כל קינאז, נוקלאוטיד cyclase או התגובה פוספור-העברת מנגנון אשר כולל נוקלאוטיד טריפוספט הידרוליזה.

ב חוץ גופית Assay פעילות עבור ppGpp (p) המעביר מ Clostridium difficile וטיהור

הרכבה in vivo היא שיטת שיבוט בלתי תלויה בקשירה המסתמכת על אנזימי תיקון DNA פנימיים בחיידקים כדי להרכיב שברי DNA על ידי רקומבינציה הומולוגית. פרוטוקול זה הוא גם חסכוני בזמן וגם בעלות יתר, מכיוון שנדרשים מעט ריאגנטים, ויעילות השיבוט יכולה להגיע עד 99%.

שימוש במכלול In Vivo לבניית פלסמיד ביעילות גבוהה

מאמר זה מתאר מתודולוגיה לביטוי יתר של Nsp15 רקומביננטי, נוקלאז רעיל, במערכת ביטוי C41(DE3), ואחריה טיהור החלבון המתויג באמצעות כרומטוגרפיה של זיקה והדרת גודל. ניתן להתאים את הפרוטוקולים האלה לחלבונים רעילים מאתגרים אחרים.

שאיבת יתר וטיהור נוקלאז רעיל מ-Escherichia coli

המחקר הנוכחי מתאר תהליך ריצוף ננו-נקבוביות של פלסמידים כאשר רצף הכרומוזומים כבר ידוע או אינו מעניין. שלב העשרת DNA בפלסמיד מבטיח עומק אופטימלי של רצף הפלסמידים וממקסם את מספר הדגימות שניתן לרצף בכל תא זרימה.

ריצוף והרכבה של פלסמידים לקריאה ארוכה באמצעות זרימות עבודה מבוססות ריצוף ננופורי

טרנספורמציה של DNA פלסמיד לתוך החיידק שימוש בשיטה הלם חום

למד שיטה יעילה לטיהור DNA פלסמיד מחיידקי E. coli תוך שימוש בצלחות Deep Well ומסנני DNA. השיטה מספקת תפוקה גבוהה של DNA איכותי בעלות נמוכה יותר מערכות מוכנות מראש.

טיהור יעיל של ה-DNA פלסמיד מתרבויות פרוקריוטים

גלה סרטונים נוספים