אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:29 דק׳ • September 26th, 2025
התחל עם צלחת המכילה חיידקים המבטאים הפרעות RNA או RNAi שגדלו מראש.
חיידקים אלה נושאים פלסמידים המכילים גן עמידות לאנטיביוטיקה והכנסת גן מטרה המייצרת RNA או dsRNA דו-גדילי כדי לעכב ביטוי גנים ספציפי במארח.
בעזרת סיכה סטרילית, העבירו את המושבות לצלחת באר עמוקה המכילה מדיום בתוספת אנטיביוטיקה.
דגרו את הצלחת עם טלטול לצמיחת חיידקים אחידה, שם הבארות העמוקות מספקות אוורור.
האנטיביוטיקה מסלקת חיידקים שחסרים את הפלסמיד, ומבטיחה שרק חיידקים נושאי פלסמיד ישרדו.
צנטריפוגה את הצלחת כדי להפריד בין החיידקים, והשליכו את הסופרנטנט.
השעו מחדש את החיידקים בתמיסת מלח חוצצת כדי לייצב אותם.
הוצא את החיידקים המרחפים לצלחת מרובת בארות המכילה מדיום עשיר בחומרים מזינים בתוספת אנטיביוטיקה ומשרה.
האנטיביוטיקה בוחרת חיידקים נושאי פלסמיד, בעוד המשרה מפעיל ביטוי dsRNA.
הצלחת שנזרעה בחיידקים המבטאים RNAi מוכנה לבדיקות נוספות.
כדי לבדוק מספר זני חיידקי RNAi במקביל בבאר אחת של צלחת באר בעומק 24 בארות, יש לחסן מושבה אחת מכל שיבוט של חיידקים המכילים RNAi שהוכנו בעבר לארבעה מיליליטר של קרבניצילין בתוספת LB. הנח את הצלחות לתוך אינקובטור רועד המותאם לצלחות מרובות בארות ב-37 מעלות צלזיוס ו-950 סל"ד למשך 16 שעות, לאחר מכן אוספים את החיידקים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 2,000 גרם למשך 5 דקות. שפכו את הסופרנטנט על ידי היפוך הצלחת וניעור נמרץ.
שימוש ב-100 מיקרוליטר של S בזאלי משהה מחדש את חיידקי ה-RNAi. פיפט את החיידקים המרחפים למספר מתאים של בארות של צלחת NGM מרובת בארות בתוספת IPTG וקרבניצילין ואפשר לצלחת להתייבש.