ייצור חלבון רקומביננטי והתאוששות משלפוחיות שמקורן בחיידקים

התחל בתרבית של זן חיידקים המקודד חלבונים רקומביננטיים המתויגים עם פפטיד גרעין שלפוחית, או VNp, פפטיד קצר המקדם היווצרות שלפוחית.

הוסף משרה לתרבית ודגירה. המשרה מעורר ביטוי חלבון.

VNp מוטמע בקרום הפנימי ומקדם את עקמומיות הממברנה, ועוטף את החלבונים המתויגים ב-VNp לשלפוחיות ניצנים.

מעבירים את המדיום העשיר בשלפוחית לצינור. צנטריפוגה אותו כדי להפריד את הסופרנטנט העשיר בשלפוחית.

לאחר מכן, סנן את הסופרנטנט כדי להסיר שאריות מזהמים.

לאחר מכן, העבירו את המסנן דרך מסנן ממברנה אחר כדי ללכוד שלפוחיות על פני הממברנה.

מניחים את הממברנה בכלי ומוסיפים מי מלח עם חוצץ פוספט.

נתק בעדינות את השלפוחיות והעביר את המתלה לצינור נקי.

סוניקציה של התרחיף כדי לשבש את קרומי השלפוחית ולשחרר את החלבונים.

צנטריפוגה את הליזאט להפרדת שברי קרום.

הסופרנטנט שנוצר מכיל חלבונים רקומביננטיים מטוהרים, מוכנים לניתוח.

לגרום לביטוי חלבון רקומביננטי ממקדם T7 על ידי הוספת IPTG לריכוז סופי של עד 20 מיקרוגרם למיליליטר, או 84 מיקרומולר. לאחר מתן זמן מספיק לאינדוקציה, גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה ב -3000 גרם ו -4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. העבירו את ה-supernatant דרך מסנן PES סטרילי ונטול חומרי ניקוי של 0.45 מיקרון כדי לעקר את המדיה המכילה שלפוחית לאחסון לטווח ארוך.

כדי לרכז את השלפוחיות לנפח קטן יותר, העבירו את השלפוחית הסטרילית המכילה מדיה דרך מסנן MCE סטרילי ונטול חומרי ניקוי של 0.1 מיקרון. לאחר מכן, שטפו בעדינות את הממברנה עם 0.5 עד 1 מיליליטר של מי מלח פוספט סטריליים, או PBS, והשתמשו במגרד תאים, או במפזר פלסטיק כדי להסיר בזהירות שלפוחיות מהממברנה. העבירו את תרכיז השלפוחית לצינור מיקרו-צנטריפוגה טרי באמצעות פיפטה.

ניתן לאחסן שלפוחיות מטוהרות בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס. סוניקציה של החלבון המכיל שלפוחיות במדיה הסטרילית באמצעות לוח זמנים מתאים כדי לשבש את קרומי השומנים השלפוחית ולשחרר חלבון. צנטריפוגה את המתלה הסוניקטיבי ב-39,000 גרם ו-4 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות כדי להסיר את הפסולת השלפוחית.