סינון מעכבים של פירופוסטאז הקשור לממברנה חיידקית באמצעות בדיקה קולורימטרית

פירופוספטאז הקשור לממברנה חיידקית, או mPPase, מבצע הידרוליזה של פירופוספט לאורתופוספט תוך שאיבת יוני נתרן על פני הממברנה.

כדי להעריך את השפעות המעכבים כנגד mPPases, הוסף ריכוזים הולכים וגדלים של תקני פוספט לרצועות הצינורות.

הכניסו תרכובות בדיקה, שעלולות לעכב mPPase, לתוך הצינורות, והשאירו אחת עם מים כבקרה.

הוסף mPPases משובצים בליפוזום שמקורם בחיידק התרמופילי Thermotoga maritima לכל הצינורות למעט התקנים.

אוטמים ודוגרים בטמפרטורה האופטימלית להפעלת האנזים.

הוסף נתרן פירופוספט כדי להתחיל את התגובה ולשחרר אורתופוספט.

העבירו את הצינורות לפלטפורמת קירור כדי לעצור את התגובה וצנטריפוגה להסרת עיבוי.

הוסף את המגיב מוליבדט-אסקורבט כדי להגיב עם אורתופוספט וליצור חומצה פוספומוליבדית.

הוסף את תמיסת הארסן-ציטראט כדי להפחית את החומצה וליצור קומפלקס כחול יציב.

העבירו את התכולה לצלחת מרובת בארות ומדדו את הספיגה.

ספיגה נמוכה יותר בהשוואה לבקרה מצביעה על עיכוב mPPase, בעוד שהתקנים משמשים כהתייחסות לכימות פוספט.

הוסף מיליליטר אחד של תמיסה B ל-10 מיליליטר של תמיסה A, ערבב ביד ואחסן את התמיסה על קרח.

בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסף 40 מיקרוליטר של תקן פוספט מיקרו-מולרי 0, 62.5, 250 ו-500 לתסריטי הצינור בשלוש עותקים.

לאחר מכן, הוסף 25 מיקרוליטר של תמיסה מורכבת ו -15 מיקרוליטר של תערובת תמיסת mPPase לכל צינור, למעט הצינורו