אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:04 דק׳ • October 30th, 2025
התחל עם תאי אמבה מסוג בר Dictyostelium discoideum תלויים במאגר קר.
המאגר מספק סביבה יונית השומרת על יציבות הממברנה.
לאחר מכן, הוסף את תאי האמבה לצינור המכיל פלסמיד עם גן המטרה.
מערבבים בעדינות את התמיסה כדי להביא את הפלסמידים למגע הדוק עם משטח האמבה.
העבירו את התערובת לקוביית אלקטרופורציה מקוררת מראש ובצעו אלקטרופורציה.
במהלך האלקטרופורציה, הפולסים החשמליים יוצרים נקבוביות חולפות בקרום התא.
הפלסמיד נכנס דרך נקבוביות אלה לציטופלזמה ולאחר מכן עובר לגרעין.
לאחר מכן, העבירו את תאי האמבה לצלחת פטרי המכילה מדיום נוזלי בתוספת חיידקי הזנה.
האמבה צורכת חיידקים באמצעות פגוציטוזיס, מספקת חומרים מזינים חיוניים להתאוששות התאים ומאפשרת ביטוי פלסמיד.
חיידקי הזנה תומכים בטרנספקציה בתאי אמבה מסוג בר, ללא צורך בזנים מיוחדים הגדלים ללא חיידקים.
השעו מחדש את התאים במאגר H40.
לאחר מכן, הוסיפו 100 מיקרוליטר של התאים לצינור שמכיל מיקרוגרם אחד או שניים של דנ"א. פיפטה למעלה ולמטה כדי לערבב ולהעביר את תערובת ה- DNA של התאים לקובטה אלקטרופורציה מקוררת מראש.
אין להוסיף יותר משני מיקרוגרם DNA. ריכוז DNA גבוה יותר רעיל לתאים ומפחית את היעילות.
לאחר אלקטרופורציה, העבירו מיד את התאים לצלחת פטרי מוכנה של 10 סנטימטר ואפשרו לתאים להתאושש במשך חמש שעות.