נוהל לטיהור חלבון מתויג פוליהיסטידין מסטרפטוקוקוס מוטנס

קחו תרבית של סטרפטוקוקוס מוטנס המבטא חלבון מתויג פוליהיסטידין המופרש למדיום.

צנטריפוגה את התרבית ואיסוף הסופרנטנט העשיר בחלבון.

מוסיפים אמוניום גופרתי ודוגרים תוך ערבוב כדי לזרז חלבונים על ידי הפחתת מסיסותם.

העבירו את התמיסה לצינור, צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.

השעו מחדש את הגלולה במאגר מקשר המכיל מלחים ואימידזול נמוך כדי לייצב את החלבון.

דיאליזה של התמיסה כנגד מאגר קשירה טרי כדי להסיר עודפי מלחים.

צנטריפוגה את תמיסת הדיאליזה כדי לגלול פסולת בלתי מסיסה, ואז לסנן את הסופרנטנט.

מערבבים את התסנין עם שרף זיקה טעון ניקל ודוגרים כדי לאפשר קשירה סלקטיבית של החלבון המתויג בפוליהיסטידין ליוני הניקל.

טען את התערובת על עמודת הכרומטוגרפיה ושטוף עם מאגר מחייב כדי להסיר חלבונים לא קשורים.

לאחר מכן, הוסף מאגר פליטה עם אימידזול גבוה כדי לעקור היסטידין מיוני ניקל ולשחרר את החלבון המתויג בפוליהיסטידין.

יש לאסוף את החומר המכיל את החלבונים המטוהרים.

צנטריפוגה תרבית החיידקים מתלה למשך 20 דקות ב-10,000 פעמים גרם בארבע מעלות צלזיוס.

העבירו את חומר התרבות לכוס זכוכית של שלושה ליטר. כדי לרכז את החלבונים מהסופרנטנט התרבית, הניחו את הסופרנטנט בנפח שני ליטר על בוחש מגנטי והתחילו לערבב נמרצות. מוסיפים 1,122 גרם אמוניום גופרתי ומאפשרים למשקעים להיווצר תוך ערבוב נמרץ בארבע מעלות צלזיוס במשך תקופה של 4 שעות או למשך הלילה.

לאחר מכן, צנטריפוגה את התמיסה המשקעת אמוניום גופרתי ב-15,000 פעמים גרם למשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. לשפוך את הסופרנטנט. בעזרת מרית אוספים את המשקעים ומעבירים אותם לכוס זכוכית של 200 מיליליטר.

השעו מחדש את הכדורים ב-35 מיליליטר של מאגר קשירה. לאחר מכן, העבירו כל כ-25 מיליליטר של התרחיף לצינור דיאליזה תאית מחודש. הנח את צינור הדיאליזה לתוך 2.5 ליטר של מאגר קשירת הערבוב על מערבל בארבע מעלות צלזיוס כדי לבצע דיאליזה של התרחיף.

החלף את תמיסת הדיאליזה לאחר שעתיים והמשיך בדיאליזה למשך הלילה. לאחר מכן, העבירו את המתלה הדיאליזה מהצינור לצינורות הצנטריפוגה והניחו את הצינורות בצנטריפוגה בטמפרטורה של 20,000 פעמים גרם למשך 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס. עם ציוד סינון יניקה, שפכו את הסופרנטנט על מסנן ממברנה של 0.2 מיקרומטר לסינון.

העבירו את המסנן לבקבוק של 75 מיליליטר.

כדי לפצל את ה-gtfSI המתויג בפוליהיסטידין מהמתלה המסונן, הכינו תחילה כרומטוגרפיה של זיקה מתכתית משותקת. לאחר איזון השרף לפי כתב היד, סגור את זין הצביטה של הופמן.

הוסף חמישה מיליליטר מהמתלה המסונן לתוך העמוד כדי ליצור slurry. לאחר מכן, העבירו את כל התרחיץ לתרחיף המסונן שנותר וסובבו את התערובת בעדינות במשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. טען את התערובת בחזרה לעמודה.

פתח את זין הצביטה של הופמן כדי להסיר את המתלה על ידי זרימת הכבידה. שטפו את שרף ה-IMAC עם 20 מיליליטר של מאגר קשירה ולאחר מכן, הוצאו 20 מיליליטר של מאגר פליטה כדי להשיג את ה-gtfSI הרקומביננטי.