אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:15 דק׳ • October 30th, 2025
קח צלחת מרובת בארות המכילה חיידקים פתוגניים מהונדסים גנטית הגדלים עם תרכובות בדיקה שונות, יחד עם בקרות שליליות.
החיידקים נושאים פלסמיד עם גן המקודד את החלבון הפלואורסצנטי הירוק או GFP.
מקדם הגן מופעל על ידי חלבון המגיב לריכוזי di-GMP מחזוריים תוך-תאיים או c-di-GMP.
הנח את הצלחת בקורא צלחות.
השתמש בבקרה השלילית, שזוהרת בצורה מקסימלית עקב היעדר מעכב c-di-GMP, כדי להתאים את ההגדרות למדידת אות פלואורסצנטי אופטימלית.
אם תרכובת בדיקה מעכבת היווצרות c-di-GMP, רמת ה-c-di-GMP התוך-תאית יורדת.
רמות c-di-GMP מופחתות מעוררות שינוי קונפורמציה בחלבון, מה שמוביל לדיכוי המקדם ולביטוי GFP נמוך, מה שמביא לירידה בקרינה.
מדוד את הקרינה ונתח את הנתונים כדי לזהות תרכובות בדיקה המווסתות את רמות c-di-GMP תוך תאיות בחיידקים פתוגניים.
כ-30 דקות לפני המדידה הספקטרופוטומטרית, יש לחמם מראש את קורא הצלחות ל-37 מעלות צלזיוס כדי למנוע עיבוי. הסר בעדינות את אטם הכיסוי החדיר לאוויר מהצלחת לפני הקריאה.
לאחר מכן, מדוד את הצפיפות האופטית באורך גל של 600 ננומטר עם הגדרה של 10 הבזקים לבאר וזמן התייצבות של 0.2 שניות. לפני מדידת הקרינה, בצע התאמת רווח ומוקד אוטומטית על סמך באר הבקרה השלילית A24 והגדר את ערך יעד הרווח על 75%.
בחר/י התאמת מיקוד וערוץ A מימין לחלון. מדוד את הקרינה ממדווח ה-GFP בעירור מקסימלי של 485 ננומטר ופליטה מקסימ
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים