סינון של מאפנני di-GMP מחזוריים באמצעות חיידקים המבטאים חלבון מדווח פלואורסצנטי

רלוונטיות תעשייתית למנהלים

בדיקה זו מאפשרת סריקה בעוצמה גבוהה של מולקולות קטנות המווסתות את השיגנול של cyclic di-GMP, רגולטור מרכזי של virulent-ness בחיידקים פתוגניים. על ידי קישור רמות c-di-GMP לפלואורסצנציית GFP, היא מספקת קריאה כמותית וניתנת לשחזור להפחתת סיכונים של מטרות בתהליך גילוי תרופות אנטי-מיקרוביאליות. גישה זו תומכת בזיהוי מוקדם של תרכובות המעכירות את הפתוגניות החיידקית ללא לחץ בקטריצידי, ובכך מפחיתה את הסיכון לפיתוח עמידות.

יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה

גילוי מוקדם ותיקוף מטרה

• ערך מדעי: בוחן את ההשערה הטיפולית לפיה ויסות של c-di-GMP מחליש את הערירות (virulence) בפטוגנים גראם-שליליים.
• ערך תפעולי: משתמש במדווח (reporter) מקודד גנטית כדי לתקף תפקודית את c-di-GMP כמטרה ניתנת לטיפול תרופתי ב-Pseudomonas aeruginosa.
• ערך ניבוי: מאפשר מיון של תרכובות המדכאות סיגנלינג תוך-תאיים ולא את הצמיחה, על בסיס מנגנוני.

סריקה ופיתוח בדיקה

• מוכנות הבדיקה: הכנה של מערכת סטנדרטית מבוססת פלואורסצנציה לסריקת ספריות של תרכובות בפורמט של מספר בארות.
• פלט כמותי: מדידת פלואורסצנציית GFP ב-485/520 nm כדי להקריב את הטיפול בתרכובת לפעילות מקדם התלויה ב-c-di-GMP.
• שחזור: שימוש בניתוח Z-prime ובביקורות שליליות כדי להבטיח אחידות של הבדיקה בין פלטות והרצות.

מחקר תרגומי ופרה-קליני

• רלוונטיות למחלה: מתמקד ב-c-di-GMP, רגולטור שמור של היווצרות ביופילם ושל virulent (עוצמת מחלה) בפתוגנים בעלי רלוונטיות קלינית.
• המשכיות תרגומית: תומך במעבר מזיהוי פגיעות (hit identification) לאופטימיזציה של מולקולת מובילה (lead optimization) על ידי אספקת ביומרקר מכניסטי למעורבות המטרה.
• ערך להפחתת סיכונים: מפחית תוצאות חיוביות שגויות על ידי הבחנה בין מעכבי סיגנלינג ספציפיים לבין תרכובות ציטוטוקסיות כלליות באמצעות נורמליזציה של OD600.

שילוב נתיב עבודה וזרימת תהליכים

הבדיקה משתלבת בשלב הגילוי המוקדם, ומאפשרת סריקה ראשונית של ספריות כימיות לזיהוי פגיעות אנטי-וירולנטיות (anti-virulence hits) לפני אימות משני במודלים של זיהום.

• ביולוגיה של גילוי: בוחנת מעורבות של מטרה על ידי מדידת שינויים בפלואורסצנציה המשקפים את הדינמיקה התוך-תאית של c-di-GMP.
• סינון: מספקת קריאות מבוססות פלטה התואמות למבחני תגובה למינון, המתאימות לאוטומציה ומסעות סריקה בעלת תפוקה בינונית.
• אנליטיקה: מייצרת נתוני אחוזי עיכוב המנורמלים לבקרות שליליות וחיוביות לצורך דירוג תרכובות.
• מחקר תרגומי: מקשרת בין מודולציה של מטרה in vitro לבין פנוטיפים של ארגוניות מופחתת, ובכך תומכת בהחלטות go/no-go להמשך פיתוח פרה-קליני.
• שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת plug-and-play הניתנת להתאמה למפתגנים אחרים המווסתים על ידי c-di-GMP או למערכות מקדם-דווח (promoter-reporter).

השפעה תפעולית וארגונית

• ערך מדעי: מספק ביטחון מכניסטי במודולציה של המטרה, ומפחית עמימות בתוצאות של סריקה פנוטיפית.
• ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי מדידת פלואורסצנציה, כולל בקרות של הגבר (gain), מיקוד וטמפרטורה, לצורך הדירות בין מעבדות.
• ערך אסטרטגי: מאפשר תיעדוף של תרכובות בעלות פעילות אנטי-וירולנטית סלקטיבית על פני עיכוב צמיחה רחב.
• השפעה על הפורטפוליו: תומך בהשקעה מותאמת-סיכון במחלקות חדשות של חומרים אנטי-מיקרוביאליים עם פוטנציאל נמוך יותר לעמידות.

שיקולי יישום

• דורש מומחיות בגנטיקה של חיידקים, טרנספורמציה של פלסמידים ותיקוף של פרומוטר-דיווח (promoter-reporter).
• תלוי בקורא לוחות (plate reader) המסוגל לבצע מדידת OD600 באורך גל כפול וזיהוי פלואורסצנציה עם אפשרות לתכנות של הגבר (gain) ומיקוד.
• מחייב הכנה סטנדרטית של תרכובות ובדיקת סבילות ל-DMSO כדי למנוע אותות שגויים.
• כולל אופטימיזציה של זמן הדגירה, הטמפרטורה והאוורור לצמיחה עקבית של החיידקים וביטוי של הדיווח.
• מוגבל לפתוגנים או למודלים שבהם c-di-GMP מווסת פרומוטר המבטא GFP; אינו ניתן להחלה אוניברסלית ללא שינוי גנטי.

שאלות נפוצות בנושאי ביו-פרמה