הערכת הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של וריאנטים של ניסין באמצעות בדיקת דיפוזיה של אגר באר

קחו תרבית לקטוקוקוס לקטיס המבטאת את הפפטידאז הקשור לממברנה NisP.

מערבבים את התרבות עם מדיום עשיר בחומרים מזינים.

מוסיפים אגר מותך, מערבבים ויוצקים לצלחת לפיזור אחיד של L. lactis באגר.

לאחר שהתמצק, אגרוף בארות לתוך האגר.

לאחר מכן, קח E. coli רקומביננטי המייצר גרסאות פרקורסור מסוג בר או שונה של הפפטיד האנטי-מיקרוביאלי ניסין.

צנטריפוגה כדי לגלול את החיידקים, להשליך את הסופרנטנטים ולהשעות מחדש את הכדורים במאגר.

סוניקציה כדי לליז את החיידקים, הצנטריפוגה ולהעביר את הסופרנטנטים לצינורות טריים.

נרמל את הליזטים לצפיפות אופטית שווה באמצעות חוצץ כדי להבטיח רמות פפטידים עקביות.

פיפט כל דגימה לבארות אגר בודדות ודגירה על הדגימות.

במהלך הדגירה, פפטידי מבשר הניסין מתפזרים לתוך האגר ונבקעים על ידי NisP, ויוצרים ניסין בוגר.

ניסין בוגר מעכב את צמיחת הלקטובצילוס לקטיס , ויוצר הילות ברורות סביב הבאר.

השווה את גדלי ההילה כדי להעריך את הפעילות האנטי-מיקרוביאלית של וריאנטים של ניסין.

הוסף מיליליטר אחד של תרבית קדם לקטוקוקוס לקטיס ל-25 מיליליטר של מרק 2X M17 המכיל 10 מיקרוגרם למיליליטר כלורמפניקול ושני אחוז גלוקוז. לאחר מכן, מוסיפים 25 מיליליטר אגר מותך פושר, מערבבים ויוצקים את התמיסה לצלחת פטרי גדולה. תוך שמירה על תנאים סטריליים, יבש את הצלחת למשך 10 עד 15 דקות.

לאחר מכן, יש לעקר את הקצוות של פיפטת פסטר מזכוכית על ידי