כימות יחידות יוצרות מושבה של חיידקים הקשורים למעיים בזבובי דרוזופילה

התחל עם מיקרופלייט המכיל הומוגנטים שהוכנו מזבובי דרוזופילה . זבובים אלה הכילו אוכלוסייה מבוקרת של חיידק ספציפי במעיים שלהם.

ההומוגנטים מכילים רקמות זבוב שעברו ליזה וחיידקי מעיים משוחררים.

שאפו את החיידקים המרחפים ודללו באופן סדרתי על פני מספר מיקרו-פלטות.

אתר נפחים קטנים מכל דילול על צלחות אגר, וודא שהטיפות יישארו מופרדות.

דגירה כדי לאפשר לחיידקים להתרבות למושבות גלויות.

צלם תמונות של הלוחות כדי לכמת יחידות יוצרות מושבות (CFUs), המייצגות את מספר תאי החיידקים המסוגלים ליצור מושבות בודדות.

בעזרת תוכנת ניתוח תמונות, יישר כל תמונה באמצעות קו ייחוס, הגדר גבול והחל רשת אחידה כדי לפלח אותה לאזורי ספירה, שכל אחד מהם מתאים לנקודה אחת.

התאם את סף הבהירות כדי להבחין בין מושבות בודדות מהרקע, ולאחר מכן הפעל את הניתוח כדי לספור מושבות בכל נקודה ולכמת את ה-CFUs.

הנח שלוש צלחות גידול אגר MRS מלבניות עם מכסים פתוחים בארון הבטיחות הביולוגית לייבוש למשך 10 דקות לפחות. הכן שתי לוחות דילול על ידי הוספת 100 מיקרוליטר PBS לכל באר של צלחת סטרילית של 96 בארות באמצעות צינור 96 ערוצים. טען מתלה של קצות P-20 על צינור 96 הערוצים.

בצע דילול של 1:10 על ידי שאיבת 11.1 מיקרוליטר הומוגנט מלוח הדגימה. כעת, חלק אותו לצלחת הדילול הראשונה המכילה 100 מיקרוליטר PBS סטרילי לבאר. שמור את לוחית הדילול על שייקר הצלחת למשך 10 שניות ב-600 סל"ד.

מערבבים שוב על ידי פיפטינג למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים. העבירו 11.1 מיקרוליטר מצלחת הדילול הראשונה לצלחת הדילול השנייה וחזרו על שלבי הערבוב לכל דילול נוסף. לאיתור צלחות, טען שני מיקרוליטר מכל באר לתוך הצינור בן 96 הערוצים.

הורד את ראש הצינור לאט על הצלחת, הימנע מדקירה באגר, וודא שכל הכתמים חולקו. לאחר מכן, בדוק שהכתמים הנוזליים נספגים במהירות באגר ואינם רצים יחד. חזור על תהליך הציפוי עבור לוחות הדילול הנותרים כמתואר בכתב היד.

לאחר שהנוזל נספג לחלוטין באגר, הפכו את הצלחות ודגרו אותן עד שהמושבות הגיעו לגודל אופטימלי. ארגן את הצלחות בצורה הגיונית ושמור אותן בסדר מסוים בזמן הצילום. כוון אותם כך ש- A1 יהיה בפינה השמאלית העליונה עבור כל הלוחות.

לאחר הסרת מכסה הצלחת, הנח את הצלחת על ה-stagה, כשה-A1 מכוון בפינה הנכונה. דמיינו את הצלחות. העבר את התמונות למחשב ושנה את שמותיהם, כולל שם הניסוי, סוג המדיה, גורם הדילול ופרטים רלוונטיים אחרים.

ארגן את התמונות לעיבוד לכימות בתיקיה. שמות הקבצים המבדילים בין הלוחות הופכים לכותרות עמודות עבור כל קבוצת ספירות בגיליון האלקטרוני של הפלט. הגדר/י תיקיות משנה בשם ״חתוך״ ו״קבלות״ בתיקיה.

תיקיות אלה יקבלו את קבצי הפלט. כעת הפעל את התוסף Croptacular מ-ImageJ ולחץ על אישור כדי להתחיל בחיתוך. תופיע תיבת דו-שיח לבחירת תיקיית המקור.

לחץ על OK. בחר את תיקיית המקור ולחץ על Open. לאחר מכן, לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח לבחירת ספריית היעד. בחר את תיקיית היעד ולחץ על פתח.

אם התמונה כבר ישרה, פשוט לחץ על רווח. אחרת, יישר את התמונה על-ידי ציור קו לאורך קצה שאמור להפוך לאופקי. צייר מחדש את הקו כמה פעמים שצריך אם התמונה אינה נראית ישרה.

לאחר מכן, צייר תיבת גבול לאזור הספירה והתאם את גודלו ופרופורציה שלו עד שכל הכתמים נמצאים בתוך התאים שלהם. גרור את הסמן אל מחוץ לתיבת הגבול כדי לרענן את הרשת. כאשר הרשת נראית טוב, הקש על רווח.

מכיוון שהתוסף מניח שכל התמונות מיושרות באופן זהה, ודא שהתמונה הבאה מסתובבת אוטומטית לאותה זווית כמו הראשונה. אם זה מדויק, לחץ על רווח כדי להמשיך. אחרת, יישר את התמונה כמו קודם.

הרשת גם זוכרת את אותו מיקום כמו התמונה הקודמת. התאם במידת הצורך ולחץ על רווח. הפעל את Count-On-It ובחר Gridiron.

הגדר את עוצמת מושבת הסף על סמך ערך עוצמת פיקסל עליון ותחתון. הפוך את הסף למחמיר ככל האפשר, תוך בחירת כל המושבות. לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח נדרשת פעולה כאשר הסף משביע רצון, ולאחר מכן לחץ על אישור כדי להמשיך.

בתמונה הראשונה ניתנת האפשרות להמשיך או לחזור לתפריט ההגדרות. כדי להמשיך בתהליך האצווה, לחץ על OK. לאחר מכן, בחר תיקיה לשמירת הקבלות וטבלת התוצאות. השתמש בתיקיה 'קבלות' שנוצרה קודם לכן.

לאחר התמונה הראשונה, התמונות הבאות יוגדרו כברירת מחדל לאותו סף כמו ההגדרות הקודמות. לחץ על אישור כדי להשתמש בהגדרות אלה או להתאים את ההגדרות.