אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:08 דק׳ • November 5th, 2025
התחל עם תרבית Neisseria gonorrhoeae שגדלה במדיום מדולדל מתכת.
מחסור במתכת מעורר את הביטוי של מובילי ממברנה חיצוניים היוזמים ספיגת מתכת כאשר הם זמינים.
הניחו קרום ניטרוצלולוזה ספוג מראש על ניירות סינון לחים והרכיבו את מנגנון כתם הנקודות.
זהו את תאי החיידקים ואפשרו לנוזל להיספג.
פרק את המנגנון, הסר את הממברנה וייבש אותו באוויר.
הוסף סוכן חוסם כדי למנוע איגוד לא ספציפי.
הכנס מחדש את הממברנה למנגנון, אטום אותה בפרפילם והרכיב מחדש.
הוסף ליגנד קשירת מתכת שמקורו במארח ודגירה עם טלטול.
הליגנד נקשר למובילי החיידקים.
הסר את הנוזל ושטוף את הממברנה כדי להסיר כל ליגנד לא קשור.
הוסף נוגדן ראשוני ספציפי לליגנד, ואחריו נוגדן משני מצומד אנזים ומגיב זיהוי קולורימטרי היוצר מוצר צבעוני.
אות גלוי מציין ביטוי של מובילי מתכות חיידקים בתנאים מוגבלים במתכת.
לאחר הדגירה ההכפלה ההמונית, יש לדלל את התרביות בשלושה כרכים של CDM. לאחר מכן, דגרו על התרביות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם ניעור במשך ארבע שעות. זמן קצר לפני סימן ארבע השעות, חתכו שלוש פיסות נייר פילטר ופיסת ניטרוצלולוזה לגודל המשוער הדרוש כדי להתאים למנגנון כתמי נקודות.
יש להשרות מראש את הניטרוצלולוזה במים נטולי יונים למשך כ-10 דקות לפני הרכבת המנגנון עם נייר סינון מתחת לניטרוצלולוז. בתום הדגירה יש לרשום את צפיפות התאים ולתקנן את הצפיפות לצפיפות סופית מתאימה. לאחר מכן, פיפטה את תרביות התאים על הניטרוצלולוז.
כאשר נייר הסינון ספג את כל הנוזל, פרק את המכשיר ואפשר לכתם להתייבש. חסום את קרום הניטרוצלולוזה למשך שעה עם תמיסת חסימה מתאימה והרכיב מחדש את מנגנון כתמי הנקודות, והחלף את נייר הסינון בסרט פרפין ליצירת אטימה חסינת דליפות מתחת לניטרוצלולוז. לדלל את הליגנד קושר המתכת המעניין ל-0.2 מיקרומולר בחוסם ולבדוק את התאים במשך שעה עם טלטול מתון.
בתום הדגירה, שואבים את הנוזל בוואקום, שוטפים את הכתם ופועלים לפי הליכים אימונולוגיים סטנדרטיים כדי לפתח את האות.