אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:38 דק׳ • October 30th, 2025
קחו תרבית של Mycobacterium smegmatis המכילה גנים הניתנים להשראת GFP ולוציפראז מוטנטי המתויג באות הפרשה.
הגן המוטנטי מקודד לוציפראז לא פעיל, אך תרגום שגוי טבעי במהלך סינתזת החלבון מייצר אנזים פעיל.
GFP משמש כבקרה פנימית לנורמליזציה של ביטוי לוציפראז.
הוסף את המשרה כדי ליזום ביטוי גנים, ולאחר מכן ציטט את התרבית לצלחת מרובת בארות.
הכנסת ריכוזים הולכים וגדלים של מולקולת בדיקה לבארות נבחרות. דגירה.
בתנאי בקרה, תרגום שגוי גורם להפרשת לוציפראז פעילה.
אם מולקולת הבדיקה מעכבת תרגום שגוי, הפרשת לוציפראז פעילה פוחתת.
העבירו את ציטוטי התרבות לצלחת שחורה ומדדו פלואורסצנטיות GFP.
צנטריפוגה לכדור התאים.
העבירו את הסופרנטנטים המכילים לוציפראז מופרש והוסיפו את המצע, שבו לוציפראז פעיל מזרז את החמצון שלו, ומייצר זוהר.
למדוד זוהר ולחשב את יחס לוציפראז/GFP; יחס נמוך יותר מצביע על תרגום שגוי מופחת עקב מולקולת הבדיקה.
כדי להתחיל, יש לחסן שני מיליליטר של מדיום 7H9 בזן המדווח החיידקי.
לנער בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך יום עד יומיים או עד שה-OD ב-600 ננומטר מגיע לשלב הנייח.
לאחר מכן, תת-תרבות ב-50 מיליליטר של מדיום 7H9 וגדלה עד שה-OD ב-600 ננומטר מגיע לשלב הנייח המאוחר. לפני שמכניסים את החיידקים לצלחת של 96 בארות, הוסיפו ATC בריכוז סופי של 50 ננוגרם למיליליטר וערבבו היטב.
הוסף 100 מיקרוליטר לבאר לצלחת שקופה עם תחתית
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים