כתם מערבי להערכת השלמות המבנית של אנטיגן חיסון חיידקי

קח ג'ל SDS-PAGE המכיל רצועות חלבון מחלקיקי חלבון-ננוליפופרוטאין ממברנה. קומפלקסים אלה נושאים את חלבון הממברנה האוליגומרי של כלמידיה או MP, אנטיגן חיסון מבטיח נגד זיהום כלמידיה .

השתמש ברצועות חלבון מ-MP אוליגומרי מטוהר כבקרה.

הרכיבו את הג'ל, קרום הכתם המערבי ורכיבי הספיגה במערכת ספיגה יבשה.

הפעל זרם חשמלי כדי להעביר את החלבונים שנפתרו על הממברנה.

הסר את הממברנה ודגר אותה במאגר המכיל חומרי ניקוי ונוגדנים ראשוניים.

חומרי הניקוי חוסמים אתרי אינטראקציה לא ספציפיים, בעוד שהנוגדנים העיקריים מכוונים ל-MP.

שטפו את הממברנה כדי להסיר נוגדנים ראשוניים לא קשורים.

דגירה עם נוגדנים משניים מצומדים פלואורופור המכוונים לנוגדנים הראשוניים.

שטפו את הממברנה כדי להסיר עודפי נוגדנים משניים.

צלם תמונות פלואורסצנטיות של הממברנה.

רצועות מולקולריות התואמות את ה-MP האוליגומרי הבקרה מאשרות את השלמות המבנית של ה-MP בתוך הקומפלקסים, ותומכות בפוטנציאל האנטיגני שלו.

פתור את הדגימות על ידי SDS-PAGE והעביר את ערימות הג'ל באמצעות מערכת מסחרית לספיגה יבשה לניתוח כתמים מערביים. הסר את הכתמים מהערימה ודגר אותם למשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס במאגר חוסם המכיל 0.2% TWEEN 20 ו-0.5 מיקרוגרם למיליליטר MAb40, או 0.2 מיקרוגרם למיליליטר נוגדן MAbHIS antiHIS-tag המכוון כנגד תג HIS מחלבון דלתא-49ApoA1.

שטפו כל כתם עם PBST שלוש פעמים במשך חמש דקות בכל כביסה. דגרו את הכתמים למשך שעה במאגר חוסם המכיל נוגדנים משניים מצומדים לפלואורופור בדילול של 1 עד 10,000. חזור על השטיפות עם PBST וצלם את התמונה באמצעות מצלמת פלואורסצנטי לאחר הכביסה הסופית.