הכנה וטרנספורמציה של חיידקים באמצעות אלקטרופורציה במתח גבוה

התחילו עם שפופרת המכילה חיידקים שחוסנו למדיום תזונתי.

דגירה עם טלטול עד שהתאים מגיעים לשלב החלוקה הפעיל.

צנטריפוגה כדי לאסוף את התאים ולהשליך את הסופרנטנט.

שטפו שוב ושוב את התאים בגליצרול קר כקרח כדי להסיר מלחים ולהשעות את הגליצרול כדי לשמור על כדאיות התאים.

הכן פלסמיד המכיל גן עמידות לאנטיביוטיקה במים סטריליים עם EDTA כדי למנוע פירוק DNA.

מערבבים את תמיסת הפלסמיד עם תאי החיידקים.

החל דופק קצר במתח גבוה כדי ליצור נקבוביות באופן זמני בקרום החיידקים.

זה מאפשר ל- DNA של הפלסמיד להיכנס לציטופלזמה.

העבירו מיד את התאים למדיום התאוששות ודגרו בטלטול.

מרכיבי המדיום תומכים בתיקון ממברנה ובביטוי גנים של עמידות לאנטיביוטיקה מקודדת פלסמיד.

מורחים את התאים על אגר מזין המכיל את האנטיביוטיקה ודוגרים עד להיווצרות מושבות.

בחרו מושבה אחת והניחו אותה על צלחת טרייה כדי לטהר את חומרי הטרנספורמציה.

כדי להתחיל בניסוי, הכינו תאים בעלי כישורים חשמליים של 10 הזן המובילים של E. coli .

העבר מושבה בודדת למיליליטר אחד של מדיה LB. דגרו את הצינור ב-37 מעלות צלזיוס תוך כדי טלטול ב-180 סל"ד. לדלל את התרבית המוקדמת ל-500 ב-25 מיליליטר של מדיה LB טרייה ולדגור את התרבית ב-37 מעלות צלזיוס עד שהיא מגיעה לשלב לוג 0.6 OD. צנטריפוגה את מתלה התא ב-5,000 סל"ד למשך 20 דקות.

לאחר הצנטריפוגה, השעו מחדש את הגלולה ב-25 מיליליטר של 10% נפח לנפח,