מיצוי וטיהור פלסטוגלובולות מחיידקים פוטוסינתטיים

התחל בתרבית של ציאנובקטריה, שהם חיידקים פוטוסינתטיים.

חיידקים אלה מכילים טיפות פלסטוגלובול עשירות בשומנים וממברנות תילקואיד, שהם מבנים קרומיים מקופלים העשירים בפיגמנטים פוטוסינתטיים.

צנטריפוגה את התרבית והשליכו את הסופרנטנט כדי להסיר פוליסכרידים חוץ-תאיים המיוצרים על ידי חיידקים. שטפו את הגלולה ואז השעו אותה מחדש במאגר.

השתמש בהומוגנייזר בלחץ גבוה כדי ליצור כוח גזירה, המשבש את דפנות התאים והממברנות.

קרע של ממברנות התילקואיד משחרר פיגמנטים פוטוסינתטיים לתוך הליזאט. שחרור הפיגמנט גורם לשינוי צבע המעיד על שיבוש תאים ושחרור פלסטוגלובול.

טען את הליזט לצינורות צנטריפוגה, ולאחר מכן הוסף תמיסת סוכרוז ליצירת שיפוע צפיפות.

צנטריפוגה להפרדת רכיבים סלולריים לפי צפיפות.

התילקואיד ורכיבים כבדים אחרים מתגלגלים בתחתית, בעוד שהפלסטוגלובולים בצפיפות נמוכה צפים למעלה כרצועה נפרדת.

אסוף את שבר הפלסטוגלובול ואחסן אותו על ידי הקפאה להמשך ניתוח.

גדל 50 מיליליטר של תרבית PCC 6802 מזן synechocystis במדיה BG11 למשך 7 עד 10 ימים כדי להגיע לשלב הנייח.

בעזרת ספקטרופוטומטר, התאם את צפיפות התא לצפיפות אופטית של 2.0 ב-750 ננומטר. כדי להסיר את הפוליסכרידים, צנטריפוגה 50 מיליליטר תרבית והסירו את הסופרנטנט. חזור על שטיפת התאים ב -50 מיליליטר מאגר A פעמיים.

השעו מחדש את הכדור השטוף ב-25 מיליליטר של מאגר A ושברו את התאים באמצעות תא לחץ צרפתי בגודל 1,100 פאונד רבוע. חזור על התהליך שלוש פעמים בתנאים קרים עד שהצבע הליזי משתנה מירוק לאדום-כחול-ירוק באור לבן. הסר את האליקווט של התא הומוגנאט והניח אותו בצד לאחסון כדגימת תא כוללת מייצגת.

מחלקים את ההומוגנאט המתקבל בשמונה צינורות אולטרה-צנטריפוגה של שלושה מיליליטר מלאים עד 2.5 מיליליטר לכל היותר בכל צינור. שכבו את ההומוגנאט הזה עם 400 מיקרוליטר של R בינוני, ומייצרים שיפוע צעד. אזנו בזהירות את הצינורות על ידי הוספת מדיום R נוסף לפי הצורך לפני צנטריפוגת הצינורות.

התילקואיד ואברונים כבדים אחרים, כולל כל גופי הפוליהידרוקסיאלקנואטים, מראים היווצרות כדורים, בעוד שפלסטוגלובולים יוצרים כרית שמנונית צהובה על או ליד החלק העליון של שיפוע הסוכרוז. קצרו את הכרית הצפה המתקבלת של פלסטוגלובולים גולמיים בעזרת מזרק והפקידו את הקציר בצינור של שני מיליליטר.

מגרדים פלסטוגלובולות מהצד של דופן צינור האולטרה-צנטריפוגה בעזרת קצה מחט במידת הצורך. המשך בעיבוד ציאנובקטריה או אחסן פלסטוגלובולות גולמיות במינוס 80 מעלות צלזיוס וטהר מאוחר יותר.