ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות תמצית תאים גולמיים חיידקים

מערכת ביטוי חלבון נטולת תאים משתמשת בליזאט תא גולמי חיידקי, המכיל את המנגנון המולקולרי החיוני לשעתוק ותרגום במבחנה.

ליזאט זה כולל גורמי שעתוק, ריבוזומים ו-RNA העברה (tRNA).

הוסף לליזאט תערובת המכילה תבנית DNA, RNA פולימראז, נוקלאוטידים וחומצות אמינו.

העבירו אותו לצלחת PCR ולצנטריפוגה כדי לאסוף את הנוזל שנדבק לקירות. אטום את הצלחת כדי למנוע אידוי.

דגירה במחזור תרמי בטמפרטורה אופטימלית כדי לתמוך בביטוי חלבון נטול תאים.

גורם השעתוק מתחבר ל-RNA פולימראז ליצירת קומפלקס שנקשר ל-DNA של התבנית.

קומפלקס זה מזרז סינתזת RNA, ומשלב נוקלאוטידים ליצירת RNA שליח (mRNA).

ה-mRNA מגייס ריבוזומים, אשר יוזמים תרגום, שבמהלכו tRNAs מספקים את חומצות האמינו המתאימות ליצירת שרשרת פוליפפטיד.

הפוליפפטיד מתקפל לחלבון פונקציונלי, מוכן ליישומים במורד הזרם.

כדי לבצע ביטוי חלבון נטול תאים באמצעות תבנית DNA להפשיר תערובת מאסטר של תמיסת אנרגיה פי 10, תערובת מאסטר של חומצות אמינו 4X ותבנית DNA בטמפרטורת החדר. לאחר מכן הסר את מלאי מעכבי ה-RNA פולימראז ו-RNAse T7 מהמקפיא של מינוס 20 מעלות צלזיוס והניח על קרח. לאחר הפשרת תבנית ה-DNA, תערובת מאסטר של תמיסת אנרגיה 10X ותערובת מאסטר של חומצות אמינו 4X, מניחים על קרח.

הכן תערובת מאסטר תגובה נטולת תאים על ידי הוספת כל רכיב בסדר המדויק לצינור של שני מיליליטר על קרח, והחליק בעדינות את הצינור לאחר כל הוספה לתערובת המאסטר. מוציאים את ליזאט התאים הגולמיים של Vibrio natriegens מהמקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס ומניחים על קרח למשך 10 עד 20 דקות עד להפשרה. הוסף את הנפח המתאים של תמצית תאים גולמיים מופשרים לתערובת מאסטר התגובה נטולת התאים וערבב בעדינות באמצעות פיפטה.

כדי לבצע ביטוי חלבון ללא תאים בנקודת קצה באמצעות thermocycler, הוסף תחילה 10 מיקרוליטר מתערובת מאסטר התגובה נטולת התאים לכל באר בתחתית צלחת PCR של 96 בארות והקפד לערבב את תערובת המאסטר על ידי הזזת הצינור בעדינות בין כל העברה לצלחת ה-PCR. צנטריפוגה את הצלחת ב-1,000 פעמים גרם למשך 10 שניות כדי לאגד כל תערובת מאסטר שאולי נדבקה לדפנות הבארות. ואז לאטום את הבארות עם דבק צלחת כדי למנוע אידוי.

מניחים את הצלחת לתוך תרמו-סייקלר המוגדר על 26 מעלות צלזיוס עם מכסה מחומם המוגדר על 105 מעלות צלזיוס. לאחר דגירה של התגובות בצלחת ה-PCR למשך שלוש שעות לפחות, ניתן לטהר, לכמת חלבונים מבוטאים ולהשתמש בהם לתהליכים במורד הזרם.