JoVE Encyclopedia of Experiments
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 4:37 דק' • October 30th, 2025
קחו תרבית של Phormidium lacuna, ציאנובקטריום נימי.
הומוגניזציה של התרבית כדי לפזר את החוטים, ואז צנטריפוגה כדי לגלול את החיידקים.
השליכו את הסופרנטנט והשעו את הגלולה במדיה עשירה בחומרים מזינים.
הוסף DNA פלסמיד המכיל חלבון פלואורסצנטי ירוק וגנים עמידים לאנטיביוטיקה על צלחת אגר בתוספת אנטיביוטיקה.
מוסיפים את תרחיף החיידקים מעל ה- DNA ודוגרים בתנאי אור.
החיידקים מפנימים את ה-DNA באמצעות פילי מסוג IV. הגנים שהוכנסו משתלבים באחד העותקים המרובים של גנום החיידקים.
הפיצו מחדש את החיידקים על צלחת אגר בתוספת אנטיביוטיקה כדי לבחור את החיידקים שעברו טרנספורמציה.
תחת מיקרוסקופ אור, זהה חוטים בריאים וירוקים המעידים על טרנספורמציה מוצלחת.
העבירו את החוטים שנבחרו לחומר נוזלי עם ריכוז אנטיביוטיקה גבוה יותר כדי להעשיר את האוכלוסייה שהשתנתה.
שוב, צלחו אותם על אגר עם רמות אנטיביוטיקה גבוהות יותר להפרדת טרנספורמציה.
דמיין ביטוי GFP תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לאשר טרנספורמציה מוצלחת.
התחל בחיסון 50 מיליליטר נוזלי F2 מדיום לכל אחת משתי הצלוחיות של 250 מיליליטר עם מיליליטר אחד של חוטי P. lacuna מתרבית ריצה. לטפח באור לבן תחת תסיסה במשך כחמישה ימים בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס.
לאחר חמישה ימים, הומוגניזציה של 100 מיליליטר של תרחיף תאי P. lacuna ב-10,000 סל"ד למשך שלוש דקות ומדוד את הצפיפות האופטית ב-750 ננומטר. לאחר מכן, צנטריפוגה את תרחיף התא למשך 15 דקות בטמפרטורה של 6,000 פעמים גרם. הסר את הסופרנטנט והשהה את הגלולה ב-800 מיקרוליטר מהנוזל הנותר ומדיום F2+ נוסף. קח שמונה צלחות אגר F2+ Bacto המכילות 120 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין ופיפטה 10 מיקרוגרם DNA לאמצע כל צלחת אגר.
פיפטה מיד 100 מיקרוליטר מתרחיף התא על גבי ה- DNA. שמור את צלחת האגר ללא מכסה על הספסל הנקי כדי לאפשר לעודפי הנוזלים להתאדות. סוגרים את הצלחת ומטפחים אותה באור לבן בחום של 25 מעלות צלזיוס למשך יומיים.
לאחר יומיים, מחלקים את החוטים של כל צלחת אגר על מספר צלחות אגר F2+ Bacto טריות המכילות 120 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין עם לולאת חיסון. טפחו את הצלחות באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס ובדקו את התרביות באופן קבוע במיקרוסקופ. לאחר 14 עד 28 יום, זהה את החוטים החומים המתים וחפש חוטים שעברו טרנספורמציה תחת המיקרוסקופ.
החוטים שעברו טרנספורמציה נראים בריאים וירוקים ושונים מרוב החוטים. העבירו כל נימה שהפכה לצלוחיות של 50 מיליליטר עם 10 מיליליטר של מדיום F2+ עם 250 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין. טפחו באור לבן בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס על שייקר והתבוננו בצמיחה עד ארבעה שבועות.
העבירו את החוטים בחזרה למדיום האגר המכיל 250 מיקרוגרם למיליליטר קנמיצין והמתינו עד שהחוטים יגדלו. לאחר מכן, הגדל שוב את ריכוז הקנאמיצין כדי להאיץ את ההפרדה. לביטוי GFP, מתבונן בחוטים בודדים עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 40X או 63X ולוכד תמונת שידור שדה בהיר ותמונת פלואורסצנטיות.