יצירת מוטציות המסומנות באנטיביוטיקה בציאנובקטריה באמצעות רקומבינציה הומולוגית

התחל בתרבית של ציאנובקטריה.

צנטריפוגה את התרבית, ולאחר מכן שטפו בעדינות את הגלולה כדי לשמר את פני השטח של החיידקים.

שוב צנטריפוגה, השעו מחדש את הכדור במדיום טרי והעבירו לצינור.

להציג וקטור שאינו משתכפל עם גן עמידות לאנטיביוטיקה. גן זה מוקף ברצפי DNA הומולוגיים לאזורים הממוקמים במעלה הזרם ובמורד הזרם של גן מטרה בגנום החיידקי.

דגירה כדי לאפשר הפנמה בתיווך פילי של הפלסמיד, המתיישב עם הרצפים ההומולוגיים ומחליף את גן המטרה באמצעות רקומבינציה, ובכך מציג מוטציה.

לפזר את התאים על אגר ולדגור, מה שמאפשר לגן העמידות לאנטיביוטיקה לבטא חלבון עמידות.

מכסים את משטח האגר באגר המכיל אנטיביוטיקה, ודוגרים. חלבון העמידות בתאים מוטנטיים משבית את האנטיביוטיקה, ומקל על הישרדותם והיווצרות המושבה.

בחרו את המושבות ששרדו וחזרו על אגר המכיל אנטיביוטיקה כדי להפריד את המוטציות העמידות לאנטיביוטיקה.

לאחר הכנת מדיה, זני ציאנובקטריה ופלסמידים, על פי פרוטוקול הטקסט, הקימו תרבית טרייה על ידי חיסון לולאה מלאה בתאים ציאנובקטריאליים לתוך 30 עד 50 מיליליטר של מדיום BG11.

גדל את התרבית באור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים-שלושה, ל-OD₇₅₀ השווה ל-0.2 עד 0.6.

לאחר הדגירה, צנטריפוגה 1 עד 2 מיליליטר של התרבית ב-2,300 גרם למשך חמש דקות. לאחר מכן, לאחר השלכת הסופרנטנט, השתמש במדיום BG11 כדי לשטוף את הכדורים פעם אחת, ופיפטינג בעד