טכניקת כרומטוגרפיית זיקה לטיהור חלבון חיידקי רקומביננטי

קחו תלייה של תאי חיידק שמבטאים חלבון מטרה עם סימון פוליהיסטידין.

סוניקט על קרח כדי למזער את פירוק החלבון. גלי קול בתדר גבוה מפצחים את התאים, משחררים תכולה תוך-תאית, כולל החלבון המטרה.

צנטריפוגה להפרדת פסולת והעברת החלבונים המכילים את הסופרנטנט למזרק.

סנן את הסופרנטנט כדי להסיר אגרגטים ולמנוע סתימה בעמודת הכרומטוגרפיה.

קחו עמודת כרומטוגרפיה עם זיקה מבוססת ניקל ואיזונו אותה לטיהור חלבונים מיטבי.

טען את הסינון על העמודה. תג הפוליהיסטידין נקשר ליוני ניקל על שרף העמודה, ומשתק את חלבוני המטרה.

שטוף את העמודה עם בופר להסרת חלבונים לא קשורים, ועקוב אחרי ספיגת UV של האלואט כדי לאשר את הסרת חלבונים שאינם מטרה.

הוסיפו בופר שחרור המכיל אימידזול, שמתחרה בתג הפוליהיסטידין על קשירת ניקל, ומשחרר את החלבונים.

קפיצה שנייה בספיגת ה-UV מאשרת את שחרור החלבון המטרה, שמוכן לשימוש במורד הזרם.

סוניקציה של התאים על הקרח באמצעות חמישה מחזורים של פולס של 15 שניות והפסקה של 30 שניות.

לאחר צנטריפוגה של הליזאט של התא בטמפרטורה של 21,000 גרם וארבע מעלות צלזיוס למשך 15 דקות, סננו את הסופרנטנט באמצעות מערכת סינון מזרקית סטרילית. השתמשו במערכת טיהור אוטומטית, המצוידת בעמוד זיקה מבוסס ניקל בנפח חמישה מיליליטר, כדי לטהר את שבר ה-RTA המסומן ב-HIS מהסופרנטנט הסטרילי של E.coli . באופן כללי, יש להשתמש במהירות הסרה של מיליליטר אחד לדקה ולקרר את כל מערכת הטיהור כדי למנוע קשירת רעלים לא יעילה ואובדן פעילות רעלנים.

איזון קצר של עמודת הזיקה עם 20 מיליליטר של בופר קישור כדי להסיר את מאגר האחסון. לאחר מכן, מרחים את הסופרנטנט הסטרילי והמסונן על עמודת האפיניטי באמצעות מזרק. שטפו את העמודה עם 25 עד 35 מיליליטר של בופר קישור כדי להסיר את החלבונים הלא קשורים מהעמודה.

בצע את שלב השטיפה עד שספיגת ה-UV ב-280 ננומטר מתקרבת לערך ההתחלתי של ה-UV. לאחר מכן, שחררו את שבר ה-RTA הקשור עם 20 עד 35 מיליליטר של בופר שחרור ושמרו את הדגימה על קרח. חשוב להתחיל את דגימת שבר ה-RTA זמן קצר לאחר שערך ה-UV 280 עולה ולהפסיק את דגימת שבר ה-RTA כשהוא מגיע שוב לקו הבסיס המקורי.