חסימת שכפול מתווכת חלבון מדכא פלואורסצנטית באשריכיה קולי

קחו תרבית E. coli מהונדסת גנטית המביעה מערך אופרטור טטרציקלין כרומוזומי (tetO).

החיידקים נושאים גם פלסמיד עם פרומוטר המושרה על ידי ערבינוז, שמניע את הביטוי של חלבון מדכא טטרציקלין המסומן ב-YFP.

העבר את התרבית למדיום תזונתי מועשר המכיל אנטיביוטיקה, ודוגר עם ניעור כדי לבחור תאים נושאי פלסמיד.

כאשר התאים גדלים, הרפליזומים נוצרים ומתחילים שכפול DNA כרומוזומי.

בשלב האקספוננציאלי, אסוף חלק כבקרה לא מושרה.

הוסיפו ערבינוז, מעורר, לתרבות הנותרת ודגרו את שתי התרבויות בשיעור.

בתרבות הלא מושרת, הדימר של AraC נשאר קשור ללולאת ה-DNA, ומעכב ביטוי מדכאים.

בתרבות המושרת, ערבינוז נקשר לדימר AraC, ומעורר ביטוי מדכא.

חלבוני המדכאים נקשרים למערך הטטו הכרומוזומלי, ועוצרים את התקדמות מזלג השכפול.

השתמש במיקרוסקופ פלואורסצנציה כדי לצפות בשתי התרביות.

מוקדי פלואורסצנציה בתרבות ה-E. coli המושרית מאשרים חסימת שכפול מתווכת חלבון מדכא.

לפרוצדורה זו משתמשים בזן E. coli הנושא מערך מפעיל טטרציקלין בפלסמיד pKM1. pKM1 מקודד ל-TetR-YFP, חלבון מדכא צהוב שמסומן על ידי חלבון פלואורסצנטי מתויג בטטרציקלין.

מדלל תרבית לילה חדשה של זן E. coli זה לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.01 במדיום מורכב מדולל עם אנטיביוטיקה הנדרשת לבחירה. הגדל את התרבית בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם ניעור לצפיפות אופטית של 600 ננומטר של 0.05 עד 0.1. הסר דגימה של 10 מיליליטר שתשמש כבקרה לא מושרה.

הוסף 0.01% ערבינוז לתרבית הנותרת כדי לעודד ייצור TetR-YFP מ-pKM1. המשך לגדל גם את התרביות הלא מושרות וגם את התרביות המושראות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם רעידות. לאחר שעה, יש לבדוק אם יש נקודת מוקד אחת בכל תא בתרבית המושרה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

אם התאים המושרים מאושרים כחסומים, כפי שמעיד שיותר מ-70% מהתאים בעלי מוקד יחיד, יש לרשום את הצפיפות האופטית ולהסיר 7.5 מיליליטר מהדגימה לניתוח באמצעות אלקטרופורזה ג'ל דו-ממדית. הסרת דגימה מקבילה מתרבות הבקרה הלא מושרת.