הערכת פעילות צ'פרון חיידקית באמצעות התפתחות תרמית של חלבון מודל

התחילו בהנחת קובטה בתוך ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה המצויד במחזיק קובטה ומערבב מבוקרי טמפרטורה.

הוסיפו בופר מחומם מראש ב-pH חומצי בינוני וקבעו את טמפרטורת המחזיק לדמות תנאי מאץ.

בדגימת הניסוי, הוסף מגן חומצה שמקורו ב-E. coli.

בדגימת הבקרה, הוסף נפח שווה.

לאחר מכן, הכנס חלבון סובסטרט רגיש לטמפרטורה ולחומצה לשתי הדגימות.

התחל לנטר את פיזור האור.

דגרו את הדגימות בתנאי מאמץ כדי לגרום להתפתחות המצע.

ב-pH חומצי בינונית, הצ'פרון הופך לפעיל ומייצב את החלבון הפתוח.

הוסף תמיסת מלח לנטרול pH והמשך לרשום פיזור אור.

בדגימת הביקורת, החזרה ל-pH ניטרלי גורמת לחלבון הפתוח להצטבר, מה שמגביר את פיזור האור.

בדגימת הבדיקה, הצ'פרון מקדם קיפול מחדש של המצע, מה שגורם להפחתת פיזור האור בהשוואה לנקודת הביקורת.

השווה את אותות פיזור האור כדי להעריך את פעילות המלווה.

הניחו קובטה קוורץ של מיליליטר אחד בתוך ספקטרופוטומטר פלואורסצנציה המצויד במחזיקי דגימות ומערבבים מבוקרי טמפרטורה.

כוון את אורך הגל של העירור והפליטה ל-350 ננומטר. הוסף את הנפחים המתאימים של בופר D מחומם מראש בערכי ה-pH הרצויים לקובט. הנפח הכולל הוא 1,000 מיקרוליטר.

כוון את הטמפרטורה במחזיק הקובט ל-43 מעלות צלזיוס. הוסף 12.5 מיקרומולר HdeB לבופר, ואחר כך 0.5 מיקרומולר MDH. התחל לנטר את פיזור האור.

דגרו את התגובה למשך 360 שניות כדי לאפשר התפתחות מספקת של MDH. העלו את ה-pH לשבע על ידי הוספת נפח של 0.16 עד 0.34 של די-פספט די-פספט לא מולרי ללא בופר והמשך להקליט פיזור אור לעוד 440 שניות. נתח את הנתונים כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.