אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:46 דק׳ • November 28th, 2025
קחו תרביות E. coli רקומביננטיות הרגישות ללחץ סביבתי.
תרבית הבדיקה נושאת פלסמיד המקודד צ'פרון המופעל על ידי חומצה, בעוד שתרבות הבקרה נושאת רק את עמוד השדרה של הפלסמיד.
החסן מושבות בודדות במדיה המושלמת באנטיביוטיקה כדי להבטיח שמירת פלסמיד ודגירה לקידום צמיחת חיידקים.
לדלל את התרביות במדיה טרייה המכילה את האנטיביוטיקה ומעורר כדי להפעיל את ביטוי המלווים.
הגדלת התרביות לשלב לוגרית-אמצע, ואז מדללת כדי להגיע לצפיפות אופטית ספציפית.
הוסף חומצה להורדת ה-pH, מה שגורם ללחץ חומצי.
בתרבות הניסוי, תנאים חומציים מפעילים את הצ'פרון, שמייצב חלבונים תאיים ומונע הצטברותם. בתרבות הביקורת, היעדר הצ'פרון גורם לחלבונים התאים להתפרק ולהצטבר.
הוסף בסיס כדי לנטרל את ה-pH ולעצור את הלחץ החומצי.
מעקב אחר צמיחת חיידקים על ידי מדידת צפיפות אופטית לאורך זמן.
גדילה מוגברת בתרבות הבדיקה מצביעה על תפקיד ההגנה של המלווה בזמן לחץ חומצי.
הכינו תרבית לילה ב-50 מיליליטר LB עם אמפיצילין, וטפחו את התאים ב-200 סל"ד ו-30 מעלות צלזיוס. מדלל תרביות לילה 40 ל-25 מיליליטר של LB עם אמפיצילין.
לגדל את החיידקים בנוכחות של 0.5% ערבינוז בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס ו-200 סל"ד לצפיפות אופטית של 600 ננומטר, או OD600 השווה ל-1.0, כדי לגרום לביטוי חלבון HDEB. לניסויי שינוי ה-pH, השתמשו ב-LB עם אמפיצילין וארבינוז כדי לדלל את התאים ל-OD600 של 0.5. כוון את ערכי ה-pH המתאימים על ידי הוספת נפחים מתאימים של חמש חומצה הידרוכלורית מולרית.
לאחר נקודות הזמן המצוינות, מנטרלים את התרביות על ידי הוספת נפחים מתאימים של חמישה הידרוקסיד נתרן מולרי. יש לעקוב אחרי גדילה של התרביות המנוטרלות והתרביות הנוזליות במשך 12 שעות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באמצעות מדידות OD.