JoVE Encyclopedia of Experiments
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 5:43 דק' • November 28th, 2025
קחו עלה שנדבק בקנדידאטוס ליבריבקטר, חיידק פתוגני.
חותכים אותו לחתיכות, הקפיאו במהירות בחנקן נוזלי, וטוחנים כדי לקרוע את תאי הצמח ולשחרר את תכולתם, כולל החיידקים.
הוסיפו בופר פירוק גרעינים וערבבו היטב.
דגרו בטמפרטורה גבוהה כדי לפרק את הממברנות, ומשחררים DNA גנומי מגרעעיני הצמח ותאי חיידקים.
מוסיפים את אנזים RNase, הפכו את הצינור לערבוב, ודגרו כדי לפירוק RNA.
הוסף תמיסת משקעים לחלבון וערבב כדי לעודד הצטברות חלבונים. צנטריפוגה לחלבון פלט ופסולת תאית.
העבר את הסופרנטנט לצינור המכיל איזופרופנול וערבב כדי להשקיע את ה-DNA לחוטים גלויים. צנטריפוגה לפליטת ה-DNA.
שטפו את הכדור באתנול כדי להסיר זיהומים, ייבשו באוויר והחזירו לחות ל-DNA.
דגרו בטמפרטורה גבוהה כדי להמיס את ה-DNA, ואז טעינו דגימה למיקרוקובטה.
באמצעות ספקטרופוטומטר, מדדו את ריכוז ה-DNA המבודד.
ראשית, השתמשו במספריים נקיים כדי לחתוך עלה טרי שלם מעץ הדר, והניחו בשקית סנדוויץ' פלסטיק נקייה. לאחר מכן, קרר את המלט והעלי על ידי הוספת כמות קטנה של חנקן נוזלי. לאחר מכן, השתמש במספריים כדי לחתוך חתיכות קטנות של רקמת העלה, בגודל של כ-1 אינץ' רבוע.
הנח את חתיכות העלים במלט כדי להקפיא אותן מיד. התחל לטחון במהירות את רקמת העלה עם המלט עד שהחנקן הנוזלי מתאדה, ונשארת אבקה ירוקה דקה. לאחר מכן, קרר מרית מתכת בחנקן נוזלי למשך 10 עד 15 שניות. לאחר מכן השתמשו במרית הקרה כדי להוציא את רקמת הקרקע מהטיט בצינור מיקרו-צנטריפוגה בנפח 1.5 מיליליטר.
השתמש בפיפטה של 1000 מיקרוליטר כדי להוסיף 600 מיקרוליטר של תמיסת פירוק גרעינים לדגימה. לאחר מכן, סחרור את הדגימה למשך שנייה עד שלוש. דגרו את הצינור בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס, באמבט מים למשך 15 דקות.
לאחר סיום תקופת הדגירה, השתמשו בפיפטה של 10 מיקרוליטר כדי להוסיף 3 מיקרוליטר של תמיסת RNase לליזאט כדי להסיר RNA. לאחר מכן, ערבבו את תוכן הצינור על ידי הפיכתו פעמיים עד חמש פעמים.
דגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות בתנור ארון. לאחר 15 דקות, הוסיפו לדגימה 200 מיקרוליטר של תמיסת שקיעת חלבון. תפעיל את הצינור במהירות גבוהה למשך 20 שניות. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה ב-13000 גרם למשך שלוש דקות.
במהלך הצנטריפוגה, הוסף 600 מיקרוליטר איזופרופנול בטמפרטורת החדר לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בנפח 1.5 מיליטר. לאחר סיום הצנטריפוגה, הסר בזהירות את הסופרנטנט מצינור הצנטריפוגה אל הצינור המכיל איזופרופנול. זרוק את הכדור.
הפוך את הצינור כדי שה-DNA יהיה גלוי, כמו חוט חוט. לאחר מכן, צנטריפוגה את הדגימה בטמפרטורה של 13000 גרם למשך דקה בטמפרטורת החדר.
פרק את הסופרנטנט לאחר הצנטריפוגה. לאחר מכן, הוסיפו 600 מיקרוליטר של 70% אתנול לכדור. הפוך את הצינור מספר פעמים כדי לשטוף את הכדור.
צנטריפוגה את הצינור ב-13000 גרם לדקה אחת. לאחר סיום הצנטריפוגה, שאפו בזהירות את הסופרנטנט. אחר כך הפוך את הצינור עם המכסה פתוח על נייר סופג לייבוש באוויר למשך 15 דקות.
לאחר הייבוש, הוסף 100 מיקרוליטר של תמיסת החזרת DNA לכדור. דגרו את תליית ה-DNA בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס באמבט מים למשך שעה. הקיש על הצינור מדי פעם בזמן הערבוב.
הוסיפו 1 מיקרוליטר מים מטוהרים במיקרו-קובטה. קרא את המים כריקים בספקטרופוטומטר. לאחר מכן, הוסף 1 מיקרוליטר של הדגימה למיקרוקובטה. הנח את המיקרוקובט על הספקטרופוטומטר, וקבל את ריכוז ה-DNA.