אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 3:17 דק׳ • November 28th, 2025
התחילו עם אגר רך מותך שנשמר בטמפרטורה חמה.
החרינו תרבית Pseudomonas syringae , הזן הניסיוני, לתוך האגר.
לאחר מכן מערבולת לזמן קצר כדי לפזר את התאים באופן שווה.
שפכו את התערובת על צלחת אגר מוצקה ומרחו אותה באופן אחיד.
סגור את המכסה ותן לו להתקשות.
לזהות סופרנטנט מסונן על פני האגר המוצק.
הסופרנטנט מכיל בקטריוצין, מולקולה אנטיבקטריאלית, שמקורה בזן P. syringae שנגרם על ידי תורם בעקבות לחץ.
דגרו את הצלחת כדי לאפשר גדילה ודיפוזיה של הבקטריוצין דרך האגר.
הבקטריוצין נקשר לקולטנים מסוימים על פני השטח בזן הבדיקה ומפריע לממברנה שלו, מה שמוביל למוות תאי.
כתוצאה מכך, נוצר אזור שקוף על האגר, המצביע על האזור שבו זן הבדיקה נהרג על ידי המולקולה האנטיבקטריאלית בקטריוצין.
מדלל את התרבות 1 עד 100 ל-KB חדש. דגרו את התרבית במשך שלוש עד ארבע שעות עם ניעור בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, הכינו אגר מים מחוטא על ידי אוטוקלבינג של תליית אגר במים טהורים במיוחד.
שמרו על האגר הרך והמותך באמבט מים בטמפרטורה של 60 מעלות צלזיוס לפני השימוש. באמצעות פיפטה סרולוגית סטרילית, העבר שלושה מיליליטר של אגר רך לצינור תרבית סטרילי. החזיר את צינור התרבית לאמבט המים כדי לשמור עליו במצב מותך.
לפני ששופכים את השכבה, אפשר לאגר המותך להתקרר, אך לא לתת לו להתמצקות.
חשוב מאוד שהאגר יישמר במצב חם ומותך לחלוטין לפני החיסון. אם לא, השכבה תראה גרעינית ויהיה קשה יותר לפרש.
במכסה סטרילי, יש לחסן 100 מיקרוליטר של תרבית המסנן של הבודק לאגר הרך ולמערבובת כדי לערבב. סובבו את התרבית ביד במשך 10 עד 15 שניות, ואז שפכו אותה לתחתית צלחת אגר. הטה את הצלחת לכל הכיוונים כדי לוודא שהאגר הרך מכסה באופן שווה את האגר התחתון.
כסו את הצלחת ותנו לה 20 עד 30 דקות להתמצקות. היזהר לא להפריע ללוח בזמן ההתקשות. לאחר ההתמצאות, יש למקם שניים עד חמישה מיקרוליטרים של סופרנטנט על השכבה.
תן לצלחות לדוג כל הלילה בטמפרטורת החדר. התבונן והקלט את התוצאות למחרת בבוקר. בשיטה זו, שני זנים של P. syringae מעוכבים על ידי חיידקים שונים. זן A רגיש לבקטריוצין במשקל מולקולרי גבוה, טיילוצין, אך אינו רגיש לבקטריוצין חלופי במשקל מולקולרי נמוך.