ניטור רציף של רעש ביולוגי בחיידקים באמצעות מיקרוסקופ טיים-לאפס

התחילו עם צלחת תרבית המכילה חיידקים המוטמעים מתחת לכרית ג'ל אגרוז כדי ליתק את החיידקים ולתמוך בצמיחת השכבה החד-שכבתית.

החיידקים מבטאים באופן קבוע חלבון פלואורסצנטי ירוק, מה שמאפשר ניטור בזמן אמת של ביטוי גן.

שפוך ג'ל אגרוז נוסף סביב הפד כדי לאטום את הדגימה ולתת לה להתקשה בטמפרטורת החדר.

אטום את הפלטה עם סרט דבק, חורר אותה כדי לאפשר חילוף גזים, והפוך אותו כדי למנוע עיבוי.

דגרו את הפלטה בטמפרטורה נמוכה כדי לייצב את הג'ל ולמנוע חלוקה חיידקית.

לאחר מכן, מרחו שמן טבילה על האובייקטיב והניחו את הפלטה על שלב מיקרוסקופ קונפוקלי.

התחל הדמיית טיימ-לאפס.

ככל ש-GFP מתבגר בהדרגה, הוא מתחיל לזהור. במהלך חלוקת התא, חלבונים פלואורסצנטיים אלו מתחלקים בין תאי הבת, וגורמים לירידה בעוצמת הפלואורסצנציה.

זה יוצר דפוס פלואורסצנציה עם שיניים מסורות, והבדלים בדפוס זה בין תאים זהים גנטית באותה סביבה מראים רעש ביולוגי בביטוי גנים.

כדי לצלם את הדגימות, הסר את הבקבוקון מהמים ותן לתמיסת הג'ל להתקרר לטמפרטורת הגוף. שפוך שלושה מילימטרים של הג'ל על היקף צלחת הדגימה. כאשר האגרוז התקשה, אוטם את הפלטה עם סרט דבק והשתמש במחט 25 גייג' כדי לחורר מספר חורים בסרט.

לאחר מכן מניחים את הלוח הפוך בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך לפחות 30 דקות כדי לאפשר לאגרוז להתקשות במלואה, תוך מניעת מיטוזה של תאים. בתוך 24 שעות, השתמשו במיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנצי כדי לאתר את הדגימה בהגדלה הנמוכה ביותר ולהפעיל את מערכת המיקוד האוטומטית של המיקרוסקופ. מרחו שמן על המטרה המתאימה והשתמשו בבקר הפלטפורמה כדי להזיז את הפלטה כדי לפזר בזהירות את השמן.

לאחר מכן הפעל שוב את המיקוד האוטומטי ופעל לפי ההמלצה ברירת המחדל לחתכי Z צעד כדי דימוי הדגימה.