אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 2:23 דק׳ • November 28th, 2025
התחילו עם Staphylococcus aureus התלוי בתמיסת כיבוי המכילה חרוזי סיליקה, המאוחסנים בטמפרטורה נמוכה לשמירת מצבו המטבלי.
הומוגניזציה של החיידקים בתנאים קרים כדי לשחרר תוכן תוך-תאי תוך מזעור פירוק אנזימי של מטבוליטים.
צנטריפוגה את הליזאט וקוצר את הסופרנאנט העשיר במטבוליט.
הוסיפו ממס אורגני לתמצית ולמערבולת כדי להשקיע מקרומולקולות ממטבוליטים מסיסים.
צנטריפוגה כדי להפיל את המשקעים ולהעביר את הסופרנטנט לבקבוקונים.
טען את המבחנות למערכת כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה.
בתוך עמודת הכרומטוגרפיה, מטבוליטים מתקשרים עם הפאזה היציבה המוצקה בהתאם לתכונותיהם הכימיות.
הוסיפו בופר כדי להוציא את המטבוליטים. לאחר מכן, כוון את המטבוליטים למקור יינון האלקטרוספריי של ספקטרומטר המסה כדי ליינן אותם.
היונים מופרדים בהתאם ליחס המסה-מטען שלהם.
הנתונים המתקבלים משווים למסד נתונים ייחוס לזיהוי המטבוליטים.
כדי להתחיל את חילוץ המטבוליטים, תחילה יש להפשיר את הדגימות על קרח רטוב. לאחר מכן לשבש את התאים בהומוגניזר עם ארבעה פיצוצים של 30 שניות במהירות 6000 סל"ד, עם שתי דקות קירור על קרח יבש בין מחזורים.
נקי את הליזטים למשך 15 דקות בצינור מיקרוצנטריפוגה מקורר מראש במהירות מרבית. לאחר הצנטריפוגה, העבר את הסופרנטנט לצינור מיקרוצנטריפוגה נקי. באמצעות מיקרופיפטה, יש להעביר חלק קטן מהדגימה לצינור מיקרוצנטריפוגה לצורך כימות תכולת הפפטידים השארית כפי שמתואר בפרוטוקול הטקסט.
אחסן את שארית הדגימה בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס. עיין בפרוטוקול הטקסט לניתוח המטבוליטים באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית וספקטרומטריית מסה.