אנציקלופדיית הניסויים של JoVE
מיקרוביולוגיה
0 צפיות • 4:19 דק׳ • February 2nd, 2026
קחו צלחת תרבית שבה זחלי Caenorhabditis מאכלסים את החיידקים המעניינים המתיישבים בלומן המעי שלהם.
הצלחת מכילה זן חיידקי ידוע כמזון. להרעיב את התולעים כדי שיטרכו את כל החיידקים וייכנסו לשלב רדום.
הוסף מדיום והעבר את התולעים לצינור.
צנטריפוגה והשליכו את הסופרנטנט.
הוסף תמיסת ניקוי, ערבב כדי להסיר חיידקים דביקים על פני השטח, השתמש בצנטריפוגה שוב, והשליך את הסופרנטנט.
חזור על השטיפה, ואז העבר את התולעים לצלחת תרבית חדשה.
אפשרו לזחילה להסיר חיידקי מזון קשורים ברפיון מהמשטח ומהלומן של המעיים, תוך שמירה על החיידקים המעניינים שמתיישבים ביציבות במעי.
חזור על שלב ההעברה והזחילה כדי להבטיח הסרה מלאה של חיידקי המזון.
הוסף את המדיום, העבר את התולעים לזכוכית שעון, ונתח כדי לחשוף את המעיים שלהן.
נתח את המעיים המכילים את החיידקים המעניינים, אסוף אותם בצינורות מלאי מים, והקפיא לשימוש עתידי.
כדי להרעיב את התולעים ולהפחתת מספר חיידקי OP50-1, יש לדגור את הנמטודות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה ימים. הוסיפו 5 מיליליטר של מדיום M9 לפלטת התולעים הרעבות לאחרונה, ואז העבירו את מדיום ה-M9 והתולעים לצינור צנטריפוגה סטרילי בקוטר 15 מ"מ כדי להסתובב במהירות של פי 1,000 גרם למשך 30 שניות בטמפרטורת החדר.
הסר את הסופרנטנט לפני שטיפת התולעים חמש פעמים עם 10 מיליליטר של M9 המכיל 0.05% טריטון X-100 על נוטאטור למשך 20 דקות. לאחר השטיפה האחרונה, הסר את הסופרנטנט מבלי להפריע לפלט ב-100 מיקרוליטר של התמיסה והעבר את ה-M9 והתולעים לפלטת NGM לא זרעה בקוטר 6 סנטימטר. תן לצלחת להתייבש בזמן שהתולעים זוחלות במשך 20 דקות כדי לעזור להסיר את OP50-1 מהקוטיקולה ומהמעי.
כאשר הצלחת יבשה, חזרו על התהליך על ידי הוספת 250 מיקרוליטר של ה-M9 והעברת התולעים לפלטת NGM חדשה באורך 6 סנטימטרים שלא זרעו כדי לאפשר לתולעים לזחול בזמן שהצלחת מתייבשת.
לאחר 20 דקות, הוסיפו 250 מיקרוליטר של ה-M9 ללוח והעבירו 100 מיקרוליטר מה-M9 יחד עם תולעים לזכוכית שעון נקייה.
לאחר מכן כרתו את ראש הנמטודות באמצעות מחט מזרק 26 גייג' תוך החזקת התולעת עם מחט מזרק 26 גייג' נוספת.
לאחר כריתת הראש, המעי, גוש גרגירי והגונד השקופה יתרחקו באופן טבעי מגוף הנמטודה, יחתכו חתיכה מהמעי החשוף ויעבירו מעי מפורק יחיד לצינור PCR בנפח 0.5 מיליליטר המכיל 10 מיקרוליטר מים סטריליים. חזור על ההליך לאיסוף מעיים מחמישה בעלי חיים שונים לפחות בצינורות PCR.
הקפיאו את צינורות ה-PCR בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס למשך מינימום של 5 דקות. יש להפשיר את דגימות המעי לפני ביצוע PCR וריצוף לזיהוי.